非小细胞肺癌组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达与患者生存期的关系

马睿,姜博文,董琪,牛凯星,林思祥

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的一种类型,占肺癌比例的85%以上,其发病率和病死率较高[1-2]。NSCLC症状包括咳嗽、咯痰、呼吸困难等[3]。NSCLC早期无明显症状,大多数患者被确诊时已为中晚期,从而失去最佳治疗机会,且影响患者预后效果[4]。因此,寻找有效的生物标志物对NSCLC患者预后生存期进行评估,可以帮助医生更好地了解患者的治疗和恢复情况,指导治疗方案的制定和调整[5]。lncRNA FOXD2-AS1可作为一种致癌基因,在多种癌症(胃癌、肺癌、宫颈癌等)中表达下调可抑制细胞周期进程,增强癌细胞的放射敏感性[6-9]。miR-1913与前列腺癌、骨肿瘤、膀胱癌等多种癌症进展相关,可作为癌症的生物标志物[10]。目前,关于lncRNA FOXD2-AS1和miR-1913在NSCLC中的研究还相对较少,因此本研究分析NSCLC患者癌组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的表达,以及与患者生存期的关系,以期为提高患者生存期提供一定的理论依据,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年11月—2019年11月滨州医学院烟台附属医院肿瘤中心收治的NSCLC患者100例作为研究对象,男57例,女43例,年龄45～70 (54.37±6.54)岁。本研究已经获得医院伦理委员会批准(1709251),NSCLC患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1) 纳入标准:①经临床病理确诊为NSCLC[11];②患者入组前未接受过任何手术、放疗、化疗等抗肿瘤治疗。(2)排除标准:①NSCLC复发;②合并其他部位恶性肿瘤者;③伴有其他脏器功能严重损伤者;④合并自身免疫性疾病者;⑤临床病例及随访资料不全者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达水平检测:采集NSCLC外科手术切除的癌组织和癌旁组织(距离癌组织>5 cm),液氮下速冻。取待检组织,研磨并以细胞裂解液裂解,采用TRIzol法抽提组织总RNA,按照逆转录试剂盒(购于美国Qiagen公司)说明书的操作步骤严格执行,将总RNA合成cDNA,U6作为miR-1913的内源性对照,GAPDH作为lncRNA FOXD2-AS1的内源性对照,引物由Primer-BLAST网站设计,并通过南京金斯瑞生物科技公司合成,引物序列见表1。以cDNA为模板通过LightCycler 480II型 qRT-PCR仪(美国ABI公司)以实时荧光定量—聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测患者组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达水平,重复3次,采用2-△△Ct法计算目的基因lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的相对表达量。

1.3.2 随访:以微信、电话及门诊复查的方式对所有受试者进行为期3年的随访,随访率为100%,随访开始于手术当天,随访终点为NSCLC患者死亡或者至2022年11月,必要时行影像学检查。统计随访结束时NSCLC患者的生存和死亡人数。根据术后3年预后情况分为生存组58例与死亡组42例。

2 结 果

2.1 不同组织 lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913表达水平比较 与癌旁组织比较,NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1表达水平升高(P<0.01),miR-1913表达水平降低(P<0.01),见表2。

表2 癌旁组织和NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1 与miR-1913表达水平比较

2.2 生存组与死亡组患者NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913表达水平比较 与生存组比较,死亡组患者NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1表达水平升高(P<0.01),miR-1913表达水平降低(P<0.01),见表3。

表3 生存组和死亡组患者NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913表达水平比较

2.3 NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913表达水平的相关性 Target Scan Human网址预测lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913间存在结合位点,见图1。NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913表达水平呈负相关(r=-0.406,P<0.001)。

图1 lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913间结合位点

2.4 NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达在不同临床病理特征中的差异比较 根据NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达水平的平均值,将患者lncRNA FOXD2-AS1表达<1.22作为lncRNA FOXD2-AS1低表达亚组54例,≥1.22作为lncRNA FOXD2-AS1高表达亚组46例;miR-1913表达<0.84作为miR-1913低表达亚组53例,≥0.84作为miR-1913高表达亚组47例。结果显示,不同性别、年龄、肿瘤大小、组织学类型的NSCLC患者lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、发生淋巴结转移、低分化程度的NSCLC患者lncRNA FOXD2-AS1高表达比例高于TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、中/高分化程度的NSCLC患者(P均<0.05)。TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、发生淋巴结转移、低分化程度的NSCLC患者miR-1913低表达比例高于TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期、未发生淋巴结转移、中/高分化程度的NSCLC患者(P均<0.01),见表4。

表4 NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达在不同临床病理特征中的差异 [例(%)]

2.5 NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达与生存期的关系 Kaplan-Meier法分析结果显示,lncRNA FOXD2-AS1高表达NSCLC患者3年生存率为43.48%(20/46),低于lncRNA FOXD2-AS1低表达患者的70.37%(38/54)(χ2=7.830,P=0.005);miR-1913高表达患者3年生存率为70.21%(33/47),高于miR-1913低表达NSCLC患者的47.17%(25/53)(χ2=6.125,P=0.013),见图2。

图2 lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913表达与NSCLC患者生存期的关系Fig.2 Correlation between expression of lncRNA FOXD2-AS1 and miR-1913 and survival of patients with NSCLC

2.6 Cox分析NSCLC患者预后的影响因素 以NSCLC患者生存状态为因变量,以lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913、TNM分期、淋巴结转移、分化程度为自变量,lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913为连续变量,TNM分期(赋值:Ⅲ+Ⅳ期为“1”;Ⅰ+Ⅱ期为“0”),淋巴结转移(赋值:是为“1”;否为“0”),分化程度(赋值:低分化为“1”;中/高分化为“0”),进行多因素Cox分析,结果显示:miR-1913高是NSCLC患者预后的保护因素(P<0.01),lncRNA FOXD2-AS1高、TNM Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移、分化程度低是NSCLC患者预后的危险因素(P<0.01),见表5。

表5 Cox分析NSCLC患者预后的影响因素

3 讨 论

NSCLC的致病机制较为复杂,发病率和病死率较高。近年来,关于NSCLC治疗和诊断的方式不断改善,其术后局部复发或远处转移率仍然较高,预后效果较差[12-13]。目前NSCLC评估主要以影像学检查为基础,其检出率较低,患者往往在NSCLC中晚期才被检出,临床治疗干预时间缩短,治疗预后效果较差,死亡率增加[14-15]。因此本研究分析NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的表达,探究其与患者生存期的关系,以期改善NSCLC患者预后。

LncRNA FOXD2-AS1作为lncRNA家族的一员,在结直肠癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤组织中高表达[16]。Guo等[9]研究表明,lncRNA FOXD2-AS1在胃癌患者组织中表达上调,敲低可抑制细胞增殖和细胞周期进程,促进细胞凋亡。Yang等[17]研究发现,lncRNA FOXD2-AS1高表达可以促进结直肠癌细胞的增殖。Wang等[18]研究发现,激活lncRNA FOXD2-AS1/miR-31/CDK1轴可促进胶质瘤的发展进程。在本研究中,NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1表达水平升高。提示了上调lncRNA FOXD2-AS1水平可能会导致NSCLC的发生。该结果与Yuan等[19]的研究结果一致,结合以往研究结果推测敲低lncRNA FOXD2-AS1可减弱A549细胞增殖、侵袭和增加细胞凋亡。但由于目前尚无lncRNA FOXD2-AS1在NSCLC中的机制研究,仍需后续验证。另外,与生存组比较,死亡组患者lncRNA FOXD2-AS1表达水平升高,lncRNA FOXD2-AS1高表达NSCLC患者3年生存率低于lncRNA FOXD2-AS1低表达患者,提示了lncRNA FOXD2-AS1高表达会导致NSCLC患者死亡率上升。

miRNA是小的非编码RNA[20]。miR-1913作为miRNA位于人类基因组的第19号染色体上,长度为22个核苷酸,miR-1913已被证实可靶向多个基因(BCL2L11、CDK6和PTEN等基因)调节细胞凋亡、代谢等过程,在多种生物过程中发挥重要作用。miR-1913可作为癌症的生物标志物,其水平异常与多种癌症(前列腺癌、骨肿瘤、膀胱癌等)进展相关[21-22]。在本研究中,NSCLC组织中miR-1913表达水平降低,提示了miR-1913低表达与NSCLC发生有关。另外,与生存组比较,死亡组患者组织中miR-1913表达水平降低,miR-1913高表达患者3年生存率高于miR-1913低表达NSCLC患者,提示了敲低miR-1913会增加NSCLC患者死亡率,有望成为NSCLC预后生存期的评估方法。

Target Scan Human网址预测lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913间存在结合位点。NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913表达水平呈负相关,提示了lncRNA FOXD2-AS1与miR-1913之间存在靶向作用,两者相互作用影响了肺癌的进程,临床可将两者联合作为新的肺癌治疗靶点。根据Cox分析显示,miR-1913高是NSCLC患者预后的保护因素,lncRNA FOXD2-AS1高、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、分化程度低是NSCLC患者预后的危险因素。这表明lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913的表达水平可能对NSCLC患者预后具有重要的评估意义,通过调节lncRNA FOXD2-AS1和miR-1913水平,及时调整治疗方案,有助于改善NSCLC患者预后。

综上,NSCLC组织中lncRNA FOXD2-AS1表达水平升高,miR-1913的表达水平降低,两者与患者预后生存期有关。然而,本研究也存在一些限制,需要进一步的基础研究来探究lncRNA FOXD2-AS1、miR-1913影响NSCLC预后生存期的具体作用机制,提高结果的可靠性。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

马睿:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;姜博文、牛凯星:实施研究过程,资料搜集整理;董琪:进行统计学分析;林思祥:提出研究思路,分析试验数据,论文审核