半夏泻心汤对葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎影响及作用机制

汪敏，黄亚威，黄然

作者单位：江苏省中医院、南京中医药大学附属医院药学部，江苏 南京210029

炎症性肠病（inflammatory bowel disease， IBD）是一种全球性的特发性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）［1］。UC 的发病通常从结肠远端发展到整个结肠，严重者甚至可扩散至回肠末端，引起腹泻、腹痛和便血［2］。 尽管UC 的发病机制尚未明确，但是专家普遍认为氧化还原系统紊乱是UC 发生发展的重要因素［3］。细胞氧化应激存在于炎症发生和发展过程中，并对炎症环境产生重要影响［4］。核转录因子 E2 相关因子（nuclear factor erythroid 2 Related factor，Nrf2）是一种与细胞动态稳态相关的应激反应转录因子［5］，与含有抗氧化反应元件（ARE）序列的基因结合，调控下游多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达，包括血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）、醌氧化还原酶-1（NADPH quinine oxidoreductase-1，NQO-1）［6］。相关研究利用Nrf2激活剂有效改善了DSS诱导的急性和慢性结肠炎，对结肠炎治疗的研究有启发作用［7-8］。调控Nrf2/HO-1 信号通路介导的氧化应激、抗炎作用可有效治疗UC。

半夏泻心汤（Banxia Xiexindecoction， BXD）出自张仲景的《伤寒杂病论》，由半夏、黄芩、干姜、人参、黄连、炙甘草、大枣配伍组成，具有辛开苦降、寒温并用的特点，广泛用于治疗胃肠道疾病，临床效果较好。半夏泻心汤治疗UC 可明显减轻病人痛苦、加速症状消失、降低复发率［9-10］。药理研究表明，半夏泻心汤对肠道具有保护作用，与NLRP3/Caspase-1 细胞焦亡通路［11］、TLRs/NF-κB 通路［12］、肠道菌群［13］等有关。半夏泻心汤是否作用于Nrf2/HO-1通路缓解UC，尚未见报道。本研究于2023 年1—5月采用小鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium salt， DSS）建立UC 模型，明确半夏泻心汤对UC 小鼠Nrf2/HO-1 通路的影响，为半夏泻心汤缓解UC的推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂半夏、黄芩、干姜、人参、黄连、炙甘草、大枣等饮片均购自江苏省中医院中药房，并由黄亚威副主任中药师鉴定均为真品。有毒药物半夏以最大剂量9 g为基准，成人每日的用量为半夏9 g、黄芩10.8 g、干姜10.8 g、人参10.8 g、黄连3.6 g、炙甘草10.8 g、大枣7.2 g。依据临床用药剂量，根据体表面积法计算得出小鼠给药量为8.19 g/kg。上述饮片煮沸浓缩后配成含生药0.4、0.8、1.6 g/mL 药液，保存于4 ℃冰箱，备用。葡聚糖硫酸钠（DSS，批号S3045）购自美国MP 公司；美沙拉嗪（批号SS0905CA24）购自上海源叶生物科技有限公司。

活性氧自由基（reactive oxide species， ROS）测试盒（批号20210906）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（批号20211104）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测 试 盒（ 批 号20211013）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）测试盒（批号20211208）均购自南京建成生物工程研究所； HE 染色试剂盒（批号C0215）、RIPA 组织裂解液（批号P1254）、ECL 发光检测试剂盒（批号P3258）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号P0147）均购自上海碧云天生物技术有限公司；一抗Nrf2 （批号ab43005）、HO-1 （批号ab44125）和NQO-1（批号ab46732）、β-actin（批号ab45348）均购自Abcam 公司；TRIzol RNA 提取试剂（批号50175111）购自美国Invitrogen 公司；RT-qPCR 试剂盒（批号B31205-127）购自美国Bimake公司。

1.2 仪器显微镜 （IX71，日本 Olympus 公司）；组织包埋机（Arcadia，德国Leica 公司）；全自动生化分析仪（AU-5800，美国Beckman Coulter 公司）；酶标仪（SpectraMax 190，美国 MD 公司）；PCR 扩增仪（QuantStudio 3，美国ABI 公司）；凝胶电泳系统（1658033，美国Bio-Rad 公司）；凝胶成像仪（GelDoc Go，美国Bio-Rad公司）。

1.3 动物C57BL/6J雄性小鼠（20±2）g购自南通大学，合格证号为SCXK（苏）2019-0001，SPF 级，温度25 ℃，相对湿度45%，自由摄食饮水。

1.4 造模与给药60 只C57BL/6J 小鼠适应性饲养1 周后，采用随机数字表法分为6 组：空白组、模型组、美沙拉嗪组（100 mg/kg）、半夏泻心汤低剂量组（8.19 g/kg）、中剂量组（16.38 g/kg）、高剂量组（32.76 g/kg），每组10 只。除空白组外，其他各组小鼠自由饮用3% DSS 连续7 d 构建溃疡性结肠炎模型，各给药组造模同时灌胃相应药物治疗，每天1 次，连续10 d。末次给药后，禁食不禁水24 h 后，摘眼球取血，3 000 r/min 离心20 min，分离获得血清，置于-20 ℃冰箱备用。然后，脱颈椎处死小鼠，取结肠组织，一部分用于病理切片，另一部分保存于-80 ℃冰箱备用。

1.5 疾病活动指数评估根据小鼠体质量、大便性状和便血情况，计算小鼠疾病活动性指数（disease activity index，DAI），DAI评分标准见表1。

表1 小鼠疾病活动性指数评分标准

1.6 结肠组织HE 染色结肠组织用10%福尔马林固定24 h，依次经乙醇梯度脱水、石蜡包埋、切成5 μm厚度薄片后进行HE染色，采用中性树胶封片，光学显微镜下观察结肠组织病理学改变。

1.7 ELISA 法测炎症因子和氧化指标摘眼球取血后离心得血清，参照ELISA 试剂盒说明书，测定ROS、MDA、SOD、GSH-px水平。

1.8 蛋白质印迹法检测Nrf2、HO-1 和NQO-1 蛋白表达提取结肠组织蛋白后，采用BCA 法检测其浓度。取50 μg 蛋白，按1∶4 比例与loadding buffer 混合均匀，煮沸10 min 变性后上样至12% SDS-PAGE凝胶电泳进行分离，转膜，抗原封闭。分别与一抗NRF2 （1∶1 000）、HO-1 （1∶1 000）、NQO-1 （1∶1 000） 4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜5 min×3 次。与二抗室温孵育1 h，TBST 洗膜5 min×3 次，加入ECL 显影液， 采用凝胶成像系统进行拍照，并定量分析蛋白条带相对灰度值。

1.9 RT-PCR 法检测Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表达取小鼠结肠组织，提取RNA 后采用酶标仪测定其浓度。按照one-step reverse transcription PCR kit 实验过程进行扩增后检测NRF2、HO-1 和 NQO-1 mRNA表达，引物序列见表2。

表2 小鼠结肠组织RNA引物序列

1.10 统计学方法采用SPSS 26.0 统计软件分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），总体有差异进一步采用LSD-t检验进行两两比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠体质量、结肠长度改变情况与空白组相比，模型组小鼠体质量在第5、6、7、8、9、10、11 天显著减轻（P=0.042、0.037、0.028、0.044、0.036、0.032、0.029）；与模型组比较，各给药组小鼠体质量呈上升趋势，其中半夏泻心汤高剂量组在第6、7、8、9、10、11 天差异有统计学意义（P=0.033、0.025、0.034、0.041、0.035、0.027），半夏泻心汤中剂量组、低剂量组在第8、9、10、11 天差异有统计学意义（P=0.044、0.047、0.035、0.029）。空白组、模型组、美沙拉嗪组、半夏泻心汤高、中、低剂量组结肠长度分别为（12.53±0.94）、（5.63±0.45）、（10.07±0.98）、（8.97±1.20）、（8.03±0.69）、（7.53±0.69）cm。与空白组相比，模型组小鼠结肠长度明显缩短（P=0.003）；与模型组相比，半夏泻心汤低、中、高剂量组小鼠结肠长度明显延长（P=0.047、0.035、0.025），见图1。

图1 小鼠体质量、结肠长度改变：A为小鼠体质量随时间变化情况；B为小鼠结肠长度比较

2.2 小鼠病理学观察与疾病活动指数由HE染色结果可知，空白组小鼠结肠黏膜组织结构完整，杯状细胞排列紧密，未见炎症细胞浸润；模型组结肠黏膜组织、隐窝结构被破坏，杯状细胞大量消失，炎性细胞浸润，基底浆细胞增加；美沙拉嗪组小鼠结肠组织稍有受损，少量炎性细胞浸润；半夏泻心汤高剂量组小鼠结肠组织结构清晰，仅有局部组织受损，少量炎性细胞浸润；半夏泻心汤中剂量组小鼠有部分完整的结肠组织结构；半夏泻心汤低剂量组小鼠结肠组织局部损伤比较严重，炎性细胞浸润程度较高。以上结果说明半夏泻心汤可改善UC 小鼠病理损伤，且呈现明显的量效关系。与空白组比较，模型组病理组织学评分显著提高（P=0.003）。与模型组比较，各给药组可降低病理组织学评分，其中美沙拉嗪组、半夏泻心汤高剂量组、中剂量组与模型组的差异有统计学意义（P=0.002、0.027、0.023）。与空白组比较，模型组疾病活动指数明显增加（P=0.004）。与模型组比较，各给药组疾病活动指数均呈现降低趋势，其中美沙拉嗪组、半夏泻心汤高剂量组、中剂量组与模型组的差异有统计学意义（P=0.003、0.027、0.040），见图2；表3。

图2 小鼠结肠黏膜组织（HE×200）：A为空白组；B为模型组；C为美沙拉嗪组；D为半夏泻心汤高剂量组；E为半夏泻心汤中剂量组；F为半夏泻心汤低剂量组

表3 小鼠结肠黏膜组织病理组织学评分和疾病活动指数/± s

表3 小鼠结肠黏膜组织病理组织学评分和疾病活动指数/± s

注：①与空白组比较，P＜0.01。②与模型组比较，P＜0.05。

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2.3 半夏泻心汤对UC 小鼠血清中ROS、MDA、SOD 和GSH-px 的影响与空白组比较，模型组小鼠血清中ROS 和MDA 水平显著升高（P=0.016、0.010），SOD 和GSH-px 活性显著降低（P=0.001）。半夏泻心汤高、中剂量组ROS 水平显著低于模型组（P=0.016、0.012）；与模型组比较，半夏泻心汤高、中剂量组MDA 水平显著降低（P=0.011、0.048）；半夏泻心汤高剂量组、中剂量组的SOD 含量与模型组的差异有统计学意义（P=0.002、0.049）；半夏泻心汤高剂量组、中剂量组、低剂量组的GSH-px 活性与模型组均差异有统计学意义（P=0.003、0.003、0.021）。见表4。

表4 半夏泻心汤改善UC小鼠的氧化应激/± s

注：UC为溃疡性结肠炎，ROS为活性氧自由基，MDA为丙二醛，SOD为超氧化物歧化酶，GSH-px为谷胱甘肽过氧化物酶。①与空白组比较，P＜0.01。②与模型组比较，P＜0.05。

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2.4 半夏泻心汤对UC 小鼠结肠组织中Nrf2、HO-1 和NQO-1 蛋白表达的影响与空白组相比，模型组小鼠结肠组织中Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表达显著降低（P=0.010、0.016、0.004）；与模型组相比，半夏泻心汤高、中剂量组明显增加Nrf2 蛋白表达（均P=0.004）；半夏泻心汤高、中剂量组HO-1 蛋白表达明显高于模型组（均P=0.011）；与模型组相比，半夏泻心汤高、中剂量组能够显著提高NQO-1 蛋白表达（P=0.002、0.012），见图3；表5。

图3 蛋白质印迹法检测Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表达

表5 半夏泻心汤对UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表达的影响/± s

表5 半夏泻心汤对UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 蛋白表达的影响/± s

注：UC 为溃疡性结肠炎，Nrf2 为核转录因子E2 相关因子，HO-1为血红素加氧酶-1，NQO-1为醌氧化还原酶-1。①与空白组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

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2.5 半夏泻心汤对UC 小鼠结肠组织中Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA 表达的影响与空白组相比，模型组小鼠结肠组织中Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表达明显降低（P=0.015、0.026、0.033）；与模型组相比，半夏泻心汤各给药组小鼠Nrf2 表达升高，其中半夏泻心汤高剂量组与模型组的差异有统计学意义（P=0.045）；与模型组相比，半夏泻心汤各给药组小鼠HO-1 表达升高，其中半夏泻心汤高剂量组、中剂量组与模型组相比差异有统计学意义（P=0.023、0.047）；与模型组相比，半夏泻心汤各给药组小鼠NQO-1 表达升高，其中半夏泻心汤高剂量组、中剂量组与模型组相比差异有统计学意义（P=0.017、0.021），见表6。

表6 半夏泻心汤对UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表达的影响/± s

表6 半夏泻心汤对UC小鼠Nrf2、HO-1和 NQO-1 mRNA表达的影响/± s

注：UC 为溃疡性结肠炎，Nrf2 为核转录因子E2 相关因子，HO-1为血红素加氧酶-1，NQO-1为醌氧化还原酶-1。①与空白组比较，P＜0.05。②与模型组比较，P＜0.05。

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3 讨论

目前，UC 是一种全球性疾病，是结直肠癌的危险因素，但UC 的确切病因还不完全清楚。UC 的治疗非常复杂，主要是抗炎或免疫抑制剂。但是常用的治疗药物，比如氨基水杨酸、皮质类固醇和硫嘌呤经常导致严重的副作用［14］。因此，亟需寻找安全高效的UC 治疗药物。半夏泻心汤中半夏和胃降逆，消痞散结为君；干姜温中散寒，黄芩、黄连清泄里热为臣；人参、炙甘草、大枣益气健脾，和中补虚为佐。此方中药味有辛有苦，药性有寒有温，辛主升主开，苦主降主泄，寒清热，温祛寒，是调和脾胃阴阳的代表方剂。

UC 的炎性环境促使ROS 大量分泌，细胞启动抗氧化机制控制ROS 含量。过量的ROS 会引起细胞功能紊乱，导致氧化与抗氧化作用失衡［15］。过剩的ROS 引起脂质过氧化、蛋白质变性、致使基因突变，最后引起细胞氧化损伤［16］。因此，氧化应激被认为是UC 诱导和进展的潜在推动力。半夏泻心汤对UC 有免疫调节、抗炎、调节肠道菌群［13，17］等作用。半夏泻心汤可通过调节氧化应激治疗慢性萎缩性胃炎、糖尿病、脓毒症胃肠功能障碍等疾病［18-20］。氧化应激失衡是UC 的重要发病原因之一，本研究从抗氧化途径探讨半夏泻心汤治疗UC的作用机制。

Nrf2是一种细胞调控氧化应激反应的重要核转录因子，维持氧化还原动态平衡［21］。Nrf2/HO-1是一条最重要的内源性抗氧化信号通路，参与机体肿瘤、炎症反应、黏膜修复、细胞凋亡等过程［22］。激活Nrf2/HO-1 通路，可增强细胞抗氧化能力［23］。黄芩汤、薏苡附子败酱散等通过Nrf2 信号通路发挥抗氧化应激作用，从而达到治疗UC 的目的［24-25］。本研究发现，DSS 明显降低模型组中Nrf2、HO-1 和NQO-1蛋白和mRNA 含量；半夏泻心汤干预后，UC 小鼠结肠组织中Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白和mRNA 表达水平显著增加。半夏泻心汤亦能有效逆转DSS诱导的UC小鼠的氧化应激相关酶指标。

综上所述，半夏泻心汤能够缓解DSS 诱导的UC，降低结肠损伤，可能是通过Nrf2/HO-1抗氧化通路发挥治疗作用的。