前列腺癌病人血清人类泛素偶联酶E2C的表达及其对DU145细胞增殖、侵袭和转移的影响

刘凤珍，王荣，崔发财，赵伟锋

作者单位：河南省人民医院，a检验科，b肿瘤内科，河南 郑州450003

前列腺癌（PCa）是一种常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，2020年全球新发确诊病例140万人，新发死亡病例37万人，其发病率和病死率已分列世界男性恶性肿瘤的第2 位和第5 位［1-2］。近年来，随着饮食及生活方式的改变、人口老龄化水平的不断增加，我国前列腺癌发病率也呈逐步增长趋势［3］。流行病学调查研究显示［4］，我国初诊为局限性前列腺癌病人的比例仅为30%左右，大部分病人首次确诊时癌细胞已发生深层组织浸润和远处器官转移，贻误临床治疗造成病死率高，这是我国PCa 病人5 年生存率低于欧美发达国家的主要原因，因此深入研究PCa 进展分子机制，筛选肿瘤发生发展相关生物标志物对PCa 的诊断、治疗和改善病人预后是至关重要的。泛素结合酶E2C（UBE2C）是泛素结合酶E2的家族成员，也是泛素-蛋白酶体系统中的重要参与者，可通过靶向细胞周期调控因子来调控细胞周期中的关键检查点，发挥其促进细胞有丝分裂进程的作用［5］。研究［6］报道，UBE2C 异常表达可导致有丝分裂周期蛋白破坏和细胞染色体组的不稳定性增加，诱导肿瘤的发生和发展。目前在前列腺癌的研究中，邓兰等［7］通过免疫组化技术分析发现UBE2C高表达病人比UBE2C 低表达病人有着更为恶性的临床病理特征和更差的预后生存期，但UBE2C 在相关病人血清中的表达情况、临床意义以及参与癌症进展的机制目前尚未可知。本研究中首先采用基因表达交互分析数据库分析UBE2C 在前列腺癌组织中的表达情况，并进一步检测UBE2C 在前列腺癌病人血清中的表达情况，分析其临床诊断价值，并通过一系列体外实验探讨UBE2C 对前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移的影响，为研究前列腺癌发生发展的分子机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料利用GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析UBE2C 在前列腺癌病人癌组织及癌旁组织中的表达情况。前列腺癌病人纳入标准：①所有病人均为首次诊断前列腺癌且临床资料完整；②所有病人留取血液样本前未接受化疗、去势治疗等任何治疗手段；③既往无恶性肿瘤史，确诊时未发生其他类型恶性肿瘤。排除标准：①合并重要脏器器质性疾病；②合并严重自身免疫性疾病。前列腺增生（BPH）病人纳入标准：①所有病人均为首次诊断良性前列腺增生且临床资料完整；②所有病人留取血液样本前未执行前列腺电切除手术；③超声测量前列腺体积大于25 mL。排除标准：①合并膀胱结石或肿瘤；②病人患有尿路感染或前列腺炎。研究对象样本量参考公式：N=Z2×［P×（1-P）］/E2，设定Z=1.96，P=90%，E=10%。根据上述标准筛选2021 年1 月至2022 年6 月在河南省人民医院接受住院治疗的PCa病人和BPH 病人各50例，以同时期健康管理中心50例体检者做对照，冻存所有研究对象空腹静脉血离心后的血清于-80 ℃超低温冰箱。所有研究对象对研究方案均知情同意。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂与材料前列腺癌细胞株DU145 购自武汉尚恩生物科技有限公司；0.25% 胰酶、Ham's F-12K 培养基、胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素混合双抗均购自武汉普诺赛生物科技有限公司；UBE2C 酶联免疫检测（ELISA）试剂盒、兔抗人单克隆抗体（UBE2C、t-Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9 和GAPDH）、HPR 标志羊抗兔二抗和Bradford 蛋白浓度测定试剂盒均购自武汉菲恩生物科技公司；RNAeasy Isolation 试剂、通用反转录试剂盒（M-MLV）、高特异性染料法定量PCR 检测试剂盒（AceQ®qPCR SYBR Green Master Mix）购自诺唯赞生物科技公司；针对UBE2C 的小干扰RNA（si-UBE2C）及阴性对照（si-NC）由锐博生物公司设计合成。

1.3 ELISA 实验将试剂盒（双抗体夹心法）自带标准品根据说明书进行倍比稀释，不同浓度标准液各加50 μL 于96 孔板，待测样本孔中40 μL 稀释液和10 μL 血清样本，空白孔滴加稀释液作为对照。37 ℃孵育30 min，PBS 也洗涤3 次，每孔各加50 μL酶标试剂继续孵育30 min，洗净沥干水分后加入显色剂显色，在酶标以上读取450 nm 处的吸光度（OD）值。绘制标准曲线计算样本中UBE2C含量。

1.4 血清前列腺特异性抗原（PSA）检测使用罗氏全自动化电学发光免疫分析仪Cobas e601及其配套PSA 试剂盒检测血清PSA 水平，检测方法为电化学发光法，样本检测前需进行常规肿瘤标志物质控品检测，质控结果在控后方可开展样本检测工作。

1.5 细胞转染与分组将生长状态良好的DU145细胞用0.25%胰酶消化，并用含10%FBS 的Ham's F-12K 培养基调整浓度为1×109个/升，6 孔板铺板，当细胞融合度达到70%时，根据转染试剂盒说明书将si-UBE2C 和si-NC 转染细胞，继续培养48 h 后检测转染效率。实验组分为：阳性干扰组（si-UBE2C），阴性对照组（si-NC）和空白对照组。

1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）根据RNA 提取试剂盒说明书提取DU145 细胞总RNA，紫外吸收法测定其浓度和纯度。M-MLV 逆转录酶将总RNA 生成cDNA，采用AceQ®qPCR SYBR Green Master 试剂盒进行扩增： 95 ℃预变性10 min 后继续变性20 s，56 ℃退火25 s，71 ℃延伸20 s，扩增循环46 次。UBE2C 启动子引物序列（正向：GACCTGAGGTATAAGCTCTCGC；反向：CAGGGCAGACCACTTTTCCTT），GAPDH启动子引物序列（正向：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA；反向：AATGAAGGGGTCATTGATGG）。采用2-ΔΔCt法分析UBE2C mRNA表达水平。

1.7 CCK-8 实验各实验组DU145 细胞用0.25%胰酶消化，用含10%FBS的Ham's F-12K培养基调整浓度为3×108个/升，96 孔板每孔加入100 μL 细胞悬液，细胞贴壁后加入CCK-8 试剂，分别继续培养24、48和72 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

1.8 Transwell 侵袭和迁移实验迁移实验：各实验组DU145 细胞用0.25%胰酶消化，并用无FBS 的Ham's F-12K 培养基调整浓度为3×108个/升，transwell小室上室加入100 μL，套入含400 μL Ham's F-12K 培养基（含12% FBS）的下室内，继续培养48 h后取出上室，PBS 清洗下室2 次，多聚甲醛固定后用0.1%结晶紫染色，在显微镜下计数迁移细胞数。侵袭实验：需将预先稀释的Matrigel 胶包被在transwell小室底部膜上室面，其余操作步骤同迁移实验。

1.9 蛋白质印迹实验收集各实验组细胞用裂解液提取总蛋白，绘制BCA 标准曲线测定蛋白浓度。制备SDS-PAGE 电泳胶，进行蛋白上样、分离和转膜， TBST 封闭后，将PVDF 膜与蛋白激酶B（t-Akt和p-Akt）一抗、侵袭转移相关蛋白（MMP-2 和MMP-9）一抗、UBE2C 蛋白一抗和GAPDH 一抗放置冷藏冰箱孵育过夜，TBST 漂洗后，加入山羊抗兔二抗继续孵育1.5 h，用ECL 试剂使PVDF 膜显影，采用Image J进行条带分析。

1.10 统计学方法应用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析和绘图，定量资料先进行K-S正态性检验。偏态分布数据用中位数（第25、第75百分位数）［M（P25，P75）］表示，采用Kruskal-WallisH检验比较多组间差异，组内两两比较采用Bonferroni法，采用Mann-WhitneyU检验比较两独立样本间差异。正态分布数据用±s表示，采用单因素方差分析或重复测量方差分析比较多组间差异，组内两两比较采用LSD-t检验，两组间比较采用独立样本t检验。绘制受试者操作特征（ROC）曲线计算血清UBE2C 诊断前列腺癌的曲线下面积（AUC）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 UBE2C 在前列腺癌组织中和前列腺癌病人血清中高表达GEPIA 在线数据库分析结果表明，UBE2C mRNA 在492例前列腺癌组织中的中位表达水平为显著高于其在152例癌旁组织中的中位表达水平（4.08比1.21，P＜0.05）。K-S检验结果显示血清UBE2C 浓度在前列腺癌组、前列腺增生组和健康对照组中均为非正态分布（P＜0.001；P＜0.001；P=0.003）。其在前列腺癌病人中的浓度值为0.64（0.41，1.06）μg/L，显著高于前列腺增生组和健康对照组［0.28（0.22，0.39）μg/L 和0.19（0.18，0.21）μg/L，H=30.52、78.65，均P＜0.05］，采用Bonferroni 法校正后的两两比较发现，前列腺增生组血清UBE2C 浓度水平也显著高于健康对照组（H=45.82，P＜0.05）。

2.2 血清UBE2C 检测对前列腺癌诊断的效能评价对各50例前列腺癌、前列腺增生及健康对照的血清UBE2C结果进行ROC曲线分析，结果显示血清UBE2C诊断前列腺癌的AUC为0.86，将UBE2C诊断截取值选定为0.395 μg/L，约登指数最大，血清UBE2C 诊断前列腺癌的灵敏度和特异度分别为76.3%和88.9%，将血清PSA 和血清UBE2C 检测联合应用于前列腺癌诊断，AUC值为0.90，显著高于血清UBE2C 单独诊断（Z=2.31，P=0.021），其诊断前列腺癌的灵敏度和特异度分别为82.4%和89.7%。

2.3 血清UBE2C 表达与前列腺癌病人临床病理特征的关系Mann-WhitneyU检验结果显示，T3～T4期，gleason 评分＞7 分，有淋巴结转移和骨转移的前列腺癌病人中血清UBE2C 水平显著高于T1-T2 期、低gleason 评分、无淋巴结转移和无骨转移的前列腺癌病人（均P＜0.05），见表1。

表1 人类泛素偶联酶E2C （UBE2C）表达与前列腺癌病人临床病理特征的关系

2.4 沉默UBE2C 表达抑制结前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力qPCR 和蛋白质印迹法检测结果显示，阳性干扰组DU145细胞内UBE2C表达水平较阴性对照组和空白对照组显著降低（均P＜0.05），表明转染si-UBE2C 能显著下调前列腺癌DU145 细胞中UBE2C 的表达；重复测量方差分析结果显示，不同时间和不同组间细胞增殖吸光度均差异有统计学意义（F=222.31、66.34，均P＜0.05），且时间与组间存在显著的交互效应（F=11.60，P＜0.05），阳性转染组在48h 和72h 时的细胞增殖吸光度均显著高于阴性对照组和空白对照组（F=24.02、38.44，均P＜0.05）； transwell 侵袭迁移实验结果显示，阳性转染组的细胞侵袭数和细胞迁移数均显著低于阴性对照组（P=0.003，P=0.006）和空白对照组（P=0.006，P=0.004），见表2，3；图1，2。

图1 transwell实验检测DU145细胞的侵袭和迁移能力

图2 蛋白质印迹法检测DU145细胞内UBE2C蛋白表达

表2 转染si-UBE2C后各组前列腺癌细胞增殖吸光度的比较/± s

表2 转染si-UBE2C后各组前列腺癌细胞增殖吸光度的比较/± s

注：①与空白对照组比较，P＜0.05。②与阴性对照组比较，P＜0.05。

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表3 转染si-UBE2C后前列腺癌细胞UBE2C表达水平、细胞侵袭和迁移能力的变化/± s

表3 转染si-UBE2C后前列腺癌细胞UBE2C表达水平、细胞侵袭和迁移能力的变化/± s

注：①与空白对照组比较，P＜0.05。②与阴性对照组比较，P＜0.05。

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2.5 沉默UBE2C表达后其前列腺癌细胞内p-Akt、MMP-2 和MMP-9 蛋白表达降低蛋白质印迹法检测结果显示，p-Akt、MMP-2 和MMP-9 蛋白在阳性干扰组、阴性对照组和空白对照组间的表达量均差异有统计学意义（均P＜0.05），p-Akt、MMP-2 和MMP-9 蛋白在阳性干扰组中的表达量均显著低于阴性对照组（P=0.003；P＜0.001；P=0.001）和空白对照组（P=0.002；P＜0.001；P=0.002），而t-Akt 蛋白在阳性干扰组、阴性对照组和空白对照组间的表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见表4；图3。

图3 蛋白质印迹法检测DU145细胞内t-Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达

表4 转染si-UBE2C后前列腺癌细胞DU145中t-Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化/± s

表4 转染si-UBE2C后前列腺癌细胞DU145中t-Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化/± s

注：Akt为蛋白激酶B，MMP为基质金属蛋白酶。①与空白对照组比较，P＜0.05。②与阴性对照组比较，P＜0.05。

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3 讨论

PCa 早期发病隐匿，临床表现多与前列腺增生症状类似，易被临床忽视。当病人出现特征性临床表现时，癌细胞已发生周围组织浸润和远距离转移，而侵袭和转移是导致PCa 病人死亡的主要原因［8-9］。我国国家癌症中心的调查研究显示，2015年PCa 标准化生存率为69.2%，较10 年前提升了近13个百分点，这得益于PCa 诊断技术和治疗方案的不断完善和提升［10］，然而相比较西方发达国家平均80%以上的生存率［11］，我们还相差甚远。临床常用于筛查和诊断PCa的检测手段分别是前列腺癌特异性抗原（PSA）检测和组织穿刺活检［12-13］，但前者特异性不高，后者费用昂贵且是有创操作，病人接受度不高，这都造成了潜在PCa初级病人的漏诊，贻误最佳治疗时机。因此，阐明PCa 发生、发展、侵袭转移的分子机制，筛选高特异性高灵敏度的生物标志物和新的治疗靶点，对早期诊断PCa 和提高病人生存率是至关重要的。

UBE2C，又被称为泛素结合酶10（UBH10），在细胞周期过程中发挥重要作用。近来研究发现，UBE2C 异常表达导致细胞染色体不稳定和有丝分裂紊乱，促进肿瘤的发生和发展［14］。例如，Kariri等［15］报道UBE2C 在乳腺癌组织中高表达，其表达水平与p53、Ki67、EGFR、PI3K 等细胞周期相关标志物呈正相关，UBE2C 高表达是乳腺癌病人预后的独立标志物。Zhang、Yang［16］报道UBE2C 在肝细胞癌组织中高表达，其表达水平与肿瘤分期和p53 基因突变率呈正相关，与病人预后和总生存期呈负相关。UBE2C 不但具有组织特异性，其在一些类型肿瘤的病人体液中也能检测到异常表达，为肿瘤的诊断、恶性度评估及预后效果评估提供了无创性检测可能。例如，血清UBE2C 水平与胶质瘤病人的TNM分期和Karnofsky（KPS）评分相关，是评估病人预后的有效指标［17］；尿液UBE2C 检测可以评估膀胱癌的浸润程度，其诊断膀胱癌的AUC、灵敏度和特异度分别是0.78、0.71 和0.85［18］。本研究利用GEPIA 数据库分析发现，UBE2C 基因在前列腺癌组织中表达水平显著高于癌旁组织，这与相关研究报道一致，提示UBE2C 异常表达与PCa 的发生发展相关。之后通过分析PCa 病人及对照组血清样本发现，UBE2C 在PCa 病人血清中也处于高表达状态，其表达与PCa 病人的T 分期、gleason 评分、淋巴结转移和骨转移呈正相关，提示血清UBE2C 检测可用于评估PCa 病人的疾病进展状态。此外，血清UBE2C 诊断前列腺癌的AUC 为0.86，灵敏度和特异度分别为76.3%和88.9%，而将血清PSA 和UBE2C 联合用于诊断前列腺癌的AUC 为0.90，灵敏度和特异度进一步提高，表明UBE2C 可作为潜在的前列腺癌联合诊断指标之一发挥良好的诊断价值。在细胞学实验中，通过转染小干扰RNA（siRNA）的方式沉默UBE2C 的表达，前列腺癌DU145 细胞的增殖、侵袭和迁移能力均得到有效抑制。PI3K/Akt信号通路中关键基因的活化或异常表达是引起肿瘤的增殖、侵袭或转移的重要原因，研究报道UBE2C 通过影响Akt/mTOR 信号通路促进乳腺癌细胞的增殖［19］；在胰腺癌［20］的研究中，UBE2C 可激活PI3K/Akt 信号通路促进基质金属蛋白酶（MMPs）表达，UBE2C 与表皮生长因子受体（EGFR）结合，使其稳定表达并驱动PI3K-Akt 通路激活，在胰腺癌的增殖和转移过程中发挥重要作用。此外，在宫颈癌［21］的研究中也报道UBE2C 调控mTOR/PI3K/Akt 通路的表达和活性。为研究UBE2C 影响前列腺癌发生发展的机制，本研究通过蛋白质印迹法检测PI3K/Akt 信号通路关键基因的表达，结果显示UBE2C表达下调后，Akt磷酸化水平降低，PI3K/Akt 信号通路的异常活化状态得到抑制。MMP-2 和MMP-9 同属基质金属蛋白酶成员，共同参与肿瘤细胞外基质的降解，其高表达促进了PCa 的侵袭和转移过程［22］，另在一些肿瘤的机制研究［23］中还发现MMP-2 和MMP-9 作为下游靶基因受到PI3K/Akt 信号通路的调控。本研究中，在p-Akt 表达下调的同时，MMP-2 和MMP-9 表达水平也相应下调，上述结果表明UBE2C 表达水平的改变与p-Akt、MMP-2 和MMP-9 表达水平的变化存在一定联系，但UBE2C 是否通过调控PI3K/Akt/MMP-2/9 信号通路参与前列腺癌的增殖、侵袭和转移过程需要我们后续更深入地研究和探讨。