结直肠癌患者尿液中20种氨基酸靶向代谢组特征研究

祁 峰,孙玉琳,刘佳琦,郭正光,刘晓燕,孙海丹,何成彦,赵晓航,孙 伟*

(1.中国医学科学院基础医学研究所·北京协和医学院基础学院 药理系,北京100005;2.国家癌症中心·国家癌症临床研究中心·中国医学科学院癌症医院 分子肿瘤国家重点实验室,北京100021;3.吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春130033)

结直肠癌(CRC)是世界上癌症相关死亡的第二大原因[1],CRC的临床分期是与生存直接相关的预后因素,早期(Ⅰ/Ⅱ期)CRC患者的5年生存率约为90%,转移性(Ⅳ期)CRC患者的5年生存率仅为20%[2-3]。早期诊断对于结直肠癌的治疗有着重要的意义。结直肠镜检查是结直肠癌诊断的金标准,但检查过程痛苦,患者依从性低;粪便潜血检测存在假阳性率较高的问题;癌胚抗原检测的个体差异性较大且灵敏度较低;粪便DNA甲基化检测的成本较高;所以需要一种成本低廉且高灵敏度高特异性的诊断方法[4-5]。

代谢组学能够快速准确地表征生物体及其代谢途径的变化,且具有高通量的优势[6]。因为尿液样本具有易获得,收集非侵入性,代谢物含量丰富的特点,早在2009年,尿液代谢组研究发现CRC患者与健康人有明显差异[7]。后续多项研究中发现谷氨酸,组氨酸,色氨酸等常见氨基酸在CRC患者中表达异常[8-10]。本研究分析了20种常见氨基酸在CRC患者不同阶段的变化,报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

113例入组病例来自于中国医学科学院肿瘤医院2017年1月至2019年10月期间的CRC患者,Ⅰ期27例,Ⅱ期28例,Ⅲ期34例,Ⅳ期24例。所有患者均由两位资深病理医生进行病理诊断。手术前或化疗/放疗前随机采集晨起中段尿液样品。健康对照组100例,其入选标准为:(1)无良恶性肿瘤;(2)体检合格,无重要器官功能障碍;(3)肾功能正常,无蛋白尿。健康对照组为年龄和性别匹配的志愿者,无癌症病史或胃肠道症状。所有受试者均签署了知情同意书,该研究通过了中国医学科学院基础医学研究所机构评审委员会的伦理审查和批准。

1.2 材料

色谱级甲酸、乙腈(Thermo Fisher);乙酸铵(Sigma-Aldrich公司);20种氨基酸标准品(上海甄准生物有限公司);10 kDa超速离心滤器(美国PALL);300 μl上样瓶(Waters公司)。

1.3 方法

1.3.1代谢物提取 尿样制备基于以前文献报道的方法[11]。在200 μL尿样中加入200 μL乙腈,涡旋混匀,在-40℃下冷冻30 min。将混合物以14 000×g的速度离心10 min。上清液在真空下冷冻抽干。在进行LC-MS分析之前,用400 μL 50%的乙腈复溶,用10 kDa截留分子量的超速离心滤器(美国PALL)进一步过滤尿代谢物,取30 μL样本加入30 μL 50%的乙腈和140 μL纯乙腈混匀用于质谱检测。

1.3.2高效液相色谱-串联质谱检测分析 使用Waters ACQUITY H-Class LC系统(Waters,美国)与 SCIEX Triple Quad 6500质谱仪(SCIEX,美国)相结合进行靶向UPLC-MS分析。采用BEH HILIC色谱柱(2.1×100 mm,1.7 μm),流速0.3 mL/min,梯度洗脱。流动相A为0.1%甲酸水溶液,10 mM乙酸铵,85%乙腈溶液。流动相B为0.1%甲酸水溶液,10 mM乙酸铵,100%水。梯度为0～0.5 min,0溶剂B;0.5～3.5 min,0～4%溶剂B;3.5～5 min,4%～20%溶剂B;5～6 min,20%～38%溶剂B;6～8.5 min,38%～45%溶剂B;8.5～11 min,45%～100%溶剂B。柱温40℃;毛细管电压为4 500 V,碰撞气为高纯N2,压力 0.72 MPa。雾化气和干燥气均为氮气,雾化气压力为20 psi,雾化温度为450℃,干燥气流速为 14 L/min。

1.3.3方法学评估 吸取 20种氨基酸储备溶液配置混合溶液,其中精氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,缬氨酸的浓度为50 μM,谷氨酰胺,谷氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,酪氨酸的浓度为100 μM,丙氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸的浓度为1 000 μM。1倍梯度4倍稀释9次到16 000倍,64倍标准品混合样本作为质控。

CRC患者以及各阶段结直肠癌与健康对照两两间比较使用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。使用prism(版本9.0)绘制散点图。

使用MetaboAnalyst(版本6.0)构建了基于Logistic回归模型的诊断标志物组合。绘制受试者工作特征曲线(ROC),用曲线下面积(AUC)评估诊断CRC的准确性。

2 结果

2.1 方法学评估与质量控制

经靶向检测方法确定各个氨基酸的检测范围如下:精氨酸,组氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,缬氨酸的浓度范围为0.003～50 μM,谷氨酰胺,谷氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,酪氨酸的浓度范围为0.006～100 μM,丙氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸的浓度范围为0.061～1000 μM。根据氨基酸标准品梯度稀释标准曲线样本质谱信号检测值计算,得到标准曲线方程,相关系数R2均大于0.992,标准曲线在线性范围内良好。检测限根据信噪比(S∶N=3)确定,定量限根据信噪比(S∶N=10)确定,质谱响应良好,符合方法学要求。

使用标准品混合液稀释64倍的溶液(64×)作为质量稳定性控制,连续跑3针评估检测系统的稳定性,液相色谱峰保留时间相差不超0.05 min,且各氨基酸之间没有相互影响,可以实现基线分离。在样本中间随机插入64×质控样本,20种氨基酸的变异系数(CV)均小于30%,酪氨酸最低9%,组氨酸最高23%,说明检测系统稳定可靠。

氨基酸的保留时间,回归方程、相关系数、线性范围、定量下限、检测限及CV结果见表1。

表1 20种氨基酸定量曲线结果

2.2 CRC患者和健康对照分析结果

入组的113例CRC患者与100例健康对照相比,年龄性别分布无差异。根据上述检测曲线,定量20种氨基酸浓度,通过与肌酐校正后,统计分析在两组间差异结果如下:精氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,半胱氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,甘氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,苏氨酸,色氨酸,缬氨酸15种氨基酸含量差异有统计学意义(P<0.001),组氨酸差异有统计学意义(P<0.05)。丙氨酸,苯丙氨酸,丝氨酸,酪氨酸四种氨基酸差异无统计学意义(表2)。在CRC患者中,赖氨酸,组氨酸,缬氨酸,异亮氨酸含量增高(图1A)。

图1 代表性氨基酸(赖氨酸,组氨酸,缬氨酸,异亮氨酸)在两组中比较结果(1A)和用于CRC诊断的氨基酸组合ROC结果(1B)

表2 CRC患者与健康对照尿液20种氨基酸的定量比较结果

为确定可用于CRC诊断的氨基酸,对20种氨基酸的ROC结果进行了分析,其ROC结果为0.5～0.75(表3),单个氨基酸不能很好的区分CRC与健康对照。为优化氨基酸组合,将213例样本随机分为发现组(n=142)与验证组(n=71),使用Logistic回归算法构建CRC诊断模型,异亮氨酸,天冬酰胺,脯氨酸,组氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸6种氨基酸的组合在发现组/验证组的AUC分别为0.857/0.851,灵敏度为0.802/0.702,特异性为0.803/0.823(表3,图1B),组合有良好的诊断效果,优于单个氨基酸的诊断效果。

表3 氨基酸组合用于CRC诊断的结果

2.3 CRC各阶段和健康对照分析结果

Ⅰ期CRC与健康对照相比,精氨酸,谷氨酸,亮氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,缬氨酸6种氨基酸差异有统计学意义(P<0.05),半胱氨酸,异亮氨酸,酪氨酸3种氨基酸差异有统计学意义(P<0.001)。Ⅱ期CRC与健康对照相比,天冬氨酸,谷氨酰胺,组氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,苏氨酸,色氨酸7种氨基酸差异有统计学意义(P<0.05),精氨酸,天冬酰胺,半胱氨酸,谷氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,赖氨酸,缬氨酸8种氨基酸差异有统计学意义(P<0.001)。34例Ⅲ期CRC与健康对照相比,异亮氨酸,蛋氨酸,谷氨酰胺,天冬氨酸4种氨基酸差异有统计学意义(P<0.05),精氨酸,天冬酰胺,半胱氨酸,谷氨酸,甘氨酸,亮氨酸,赖氨酸,苏氨酸,色氨酸,缬氨酸10种氨基酸差异有统计学意义(P<0.001)。Ⅳ期CRC与健康对照相比,丙氨酸,精氨酸,组氨酸,赖氨酸,丝氨酸,色氨酸6种氨基酸差异有统计学意义(P<0.05),天冬酰胺,半胱氨酸,谷氨酰胺,谷氨酸,甘氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,蛋氨酸,脯氨酸,苏氨酸,缬氨酸11种氨基酸差异有统计学意义(P<0.001)(表2)。

在上述结果中,谷氨酰胺,蛋氨酸,在Ⅰ期CRC癌患者与健康对照相比虽然差异无统计学意义,但随着疾病进展有明显升高,含量有线性增长趋势。谷氨酸在Ⅲ期CRC患者中含量下降,色氨酸在IV期CRC患者中下降(图2)。

图2 代表性氨基酸(谷氨酰胺,谷氨酸,蛋氨酸,色氨酸)在CRC分期的比较结果

将上述异亮氨酸,天冬酰胺,脯氨酸,组氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸6种氨基酸组成的组合用于Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期CRC的诊断,其AUC值分别为0.847,0.843,0.897,0.896。使用10倍交叉验证模型,AUC值分别为0.785,0.796,0.849,0.828,均具有良好的诊断效果(表3,图3)。

图3 氨基酸组合在不同CRC分期的ROC结果

3 讨论

本研究通过靶向分析发现健康人群与CRC患者尿中20种氨基酸表达水平有明显差异。氨基酸对于癌症维持其增殖驱动力有重要作用,除了作为蛋白质合成底物的直接作用外,它们还可以在能量产生、驱动核苷的合成和维持细胞氧化还原同质稳态方面发挥作用。

支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)是癌细胞中的氮供体,可以作为替代来源为三羧酸循环提供燃料,促进生物能量途径。肿瘤细胞的增殖和生长需要从肿瘤微环境中获取必需的营养物质。即使在营养和氧气供应不足的情况下,肿瘤细胞也可以利用它们来维持生存,促进生物能量途径,介导脂肪生成,并调节核苷酸合成[12]。亮氨酸和异亮氨酸是癌症代谢中的重要“模块”,可以用于谷氨酸的合成,从而促进癌症进展中的生物合成[13]。研究表明,胰腺癌患者血浆中总支链氨基酸升高,可以转化为乙酰辅酶A并进入三羧酸循环[14]。

赖氨酸在肌肉组织中大量存在,可刺激钙的吸收、肉碱合成以及肌肉组织的生长和修复。既往研究发现L-赖氨酸与糖尿病和心血管疾病有关,在CRC患者尿液中下调[15]。肉碱系统是癌症代谢可塑性的关键介质,交织着关键途径、因子和代谢物,为癌细胞提供能量和生物合成需求[16]。

在本研究中发现,与健康对照相比,CRC的色氨酸代谢显著增加。在一项结肠癌血清代谢组的研究中,色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸在CRC早期有变化[17],另一项结肠癌血清代谢组研究也发现CRC早期患者血浆中色氨酸水平较低,但随着CRC进展升高[18]。色氨酸代谢在免疫系统的调节中起着重要作用,可通过犬尿氨酸途径的分解代谢抑制T细胞增殖[19]。

蛋氨酸是蛋白质合成中的一种必需氨基酸,蛋氨酸代谢与癌症发生机制有关,包括甲基化反应、氧化还原维持、多胺合成和叶酸代谢偶联以协调核苷酸和氧化还原状态,叶酸分布和蛋氨酸水平被发现是决定结肠癌细胞在CRC发育中分期的关键。蛋氨酸通过减少炎症诱导的结肠癌和抑制结肠癌发生的关键通路,与CRC风险呈负相关。蛋氨酸是 S-腺苷甲硫氨酸的前体,S-腺苷甲硫氨酸是甲基转移酶的底物,S-腺苷甲硫氨酸的减少会诱导异常的 DNA 甲基化,进而导致早期 CRC 发展[20]。CRC组织水平的研究证明,CRC患者的蛋氨酸含量低于健康人[18]。在本研究中,随着CRC的进展,蛋氨酸有线性的增长趋势,在CRC晚期与健康人相比有更明显的差异。

组氨酸、精氨酸虽然体内可以自主合成,但合成的量不足以支持每日生命活动所需,也需要从外界获取。组氨酸代谢在肿瘤迁移、侵袭和不良预后中起重要作用。磷酸组氨酸磷酸酶1可能与肌动蛋白细胞骨架的重组有关,从而影响肺癌细胞的迁移和侵袭[21]。此前报道CRC患者的尿液中组氨酸浓度显著降低[22]。

谷氨酰胺是人体内重要的非必需氨基酸,在体内参与氮循环、细胞增殖、激活自噬等生物过程,在体内可以由谷氨酸与氨经谷氨酰胺合成酶催化而成。谷氨酰胺的碳骨架在癌细胞中被氧化,促进了能量的产生和物质的积累。这种机制是癌细胞的主要能量来源。在癌组织中,谷氨酰胺需求不能通过细胞水平的巨胞饮作用和(或)自噬消化来满足。因此,许多组织上调谷氨酰胺合成酶以增加谷氨酰胺合成[23-24]。在本研究中发现,随着CRC的进展,谷氨酰胺有着线性的增长趋势。另一项关于CRC血清代谢组的研究发现,谷氨酰胺浓度变化可能反映了早期癌性病变。此外,观察到谷氨酸与CRC风险呈正相关[25]。

总之,本研究发现CRC尿液中的氨基酸水平与正常人相比有明显差异,尤其是在Ⅰ,Ⅱ期患者中,可以为CRC的早期诊断提供了新的线索,但本研究是一个单中心研究,本文的结论还有待于多中心样本验证。