肠道菌群代谢物TMAO对兔动脉粥样硬化斑块形成及狭窄程度的影响

路怀志,池 尧,赵 辉,许学升

(1.商丘市第一人民医院 心血管内科,河南 商丘476000;2.吉林大学第二医院 心内科,吉林 长春130041)

冠心病在世界范围内依然是威胁人类健康的重大公共卫生问题[1]。因此,早期发现加速斑块产生或者加快其发展速度的因素,对于降低疾病发生率具有重要意义。肠道菌群及其代谢产物是近年来研究热点,已有研究证明其与动脉硬化疾病存在一定相关性[2]。氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide,TMAO),作为肠道菌群代谢产物之一,其高水平与临床不良心血管事件发生呈正相关[3-4],但TMAO是否具有直接促进动脉粥样硬化斑块形成及进展的作用缺乏研究数据。本研究以新西兰兔为研究对象,通过TMAO干预与阻断,来评估TMAO对于斑块形成及血管管腔狭窄程度的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 健康纯种雄性新西兰白兔32只,体重3～4 Kg,购自郑州兔尔康牧业有限公司,饲养于郑州大学动物实验中心标准条件下,实验方案符合郑州大学动物实验中心要求,并经郑州大学动物研究委员会审核批准。

1.1.2主要器材及试剂 冰冻切片机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司,型号 CRYOSTAR NX50];成像系统(日本尼康,型号 NIKON DS-U3);无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司);通用型组织固定液、HE 染液套装、EVG 染液套装、Masson 染液套装、油红染液、苏木素染液、分化液及返蓝液(Servicebio公司);氯化胆碱、DMB试剂(阿拉丁公司);饲料(北京科澳协力饲料有限公司)。

1.2 方法

1.2.1将兔随机分为A、B、C、D共4组,每组8只,A组为空白对照组:普通饲料喂养;B组为模型组:低温气体损伤+高脂饮食(1%胆固醇+8%猪油+10%蛋黄粉+兔基础饲料);C组为TMAO组:低温气体损伤+高脂饮食+氯化胆碱灌胃(1.5%氯化胆碱无菌生理盐水4 ml,可促进TMAO的产生,每天1次)。D组为TMAO抑制组:低温气体损伤+高脂饮食+氯化胆碱灌胃+TMAO抑制剂饮水[含1.0%的3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)]。

1.2.2造模方法 B、C、D组兔高脂喂养1周后进行内膜损伤。建模步骤:①3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉及备皮后暴露右侧颈总动脉。②阻断血流并留置装置:利用动脉夹阻断远心端血流后再以同样方法阻断近心端血流。注射器针头于分离动脉的远心端刺入血管,生理盐水冲洗血管管腔,从近心端使用静脉输液针平行于血管纵轴方向刺入血管并留置。③进行低温气体损伤:于液氮治疗仪中注入液氮200 ml,封闭后快速连接静脉输液针。封闭液氮治疗仪后端通气孔后液氮由枪头喷出并气化为低温气体,气体经静脉输液针导入血管,颈动脉被低温气体充盈,出现膨胀,并由远心端穿刺孔喷出,持续5 s后放开液氮治疗仪后端通气孔,如此过程反复进行3次。④损伤后处理:用生理盐水冲洗动脉管腔后,进行压迫止血,止血后青霉素生理盐水冲洗手术切口,缝合皮肤创口并以碘伏消毒。术后连续3 d肌注青霉素钠40万单位预防感染。A组兔,不进行低温气体损伤,余操作同其他组。术后各组继续喂养12周。低温气体输出装置:由液氮治疗仪、一次性使用静脉输液针构成。

1.2.3血清学指标检测 分别于高脂饮食前、血管损伤后12周,采集兔外周血,检测各组血脂及TMAO水平。

1.2.4血管病理组织学切片 留取血管标本后行HE染色、Masson三色染色、弹力纤维染色及油红O染色。利用Image-Pro Plus 6.0测算斑块面积,狭窄率(斑块的像素面积/管腔的像素面积×100)。并对斑块狭窄程度及TMAO浓度进行相关性分析。

2 结果

2.1 一般情况

B组1只白兔因腹泻死亡,A、C、D组各1只白兔因麻醉过量死亡,余动物均完成实验。

2.2 各组血脂水平比较

与高脂饮食前比较,模型组、TMAO组及TMAO抑制组喂养13周后HDL-C差异没有统计学意义(P>0.05),但LDL-C、TC、TG水平均显著增高,差异存在统计学意义(P<0.05)。高脂饮食13周后3组间HDL-C、LDL-C、TG、TC差异没有统计学意义(P>0.05),与对照组比较,3组LDL-C、TC、TG水平均显著增高,差异存在统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组间LDL-C、HDL-C、TC、TG水平对比

2.3 4组间血清TMAO水平比较

喂养13周后TMAO组血清TMAO水平较余3组差异均存在统计学意义(P<0.05),较喂养前亦有显著性升高(P<0.05)。其余3组间TMAO水平差异没有统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 4组间TMAO水平对比

2.4 血管斑块染色比较

4组血管分别进行了HE、Masson、弹力纤维及油红O染色评估斑块形态及管腔狭窄情况。可见A组血管管腔内皮细胞完整,中层平滑肌细胞形态及排列正常,无斑块形成,无脂质沉积(见图1A、B、C、D)。B组血管可见斑块形成(图1E),Masson三色染色胶原纤维呈现蓝染,表达丰富,中膜平滑肌细胞与心外弹力板排列整齐(图1F);中层弹力纤维呈现规律的弯曲改变,无血管重构表现(图1G),少量脂质沉积(图1H)。C组血管从切片上来看,斑块纤维帽薄(图1I),脂质核心较大(图1I、1L),内膜中各种来源的泡沫细胞丰富,Masson三色染色显示纤维帽中蓝染的胶原纤维散在,含量明显偏少(图1J),弹力纤维染色中,部分血管中膜弹力纤维被牵拉变直,中膜变薄(图1K),均符合典型的易损斑块特点。D组血管表现整体情况类似B组(图1M、N、O、P),有斑块形成,但较C组斑块相对较小,结构更加完整。

图1 4组目标血管分别进行了HE、Masson、弹力纤维及油红O染色[A:对照组血管HE染色(×40),可见血管内膜、中膜及外膜结构完整,无斑块形成;B:对照组血管Masson染色(×40),血管壁胶原纤维丰富;C:对照组血管弹力纤维染色(×40),血管弹力板结构完整;D:对照组血管油红O染色(×40),血管内无脂质沉积;E:模型组HE染色(×40),可见血管管腔内斑块形成;F:模型组Masson染色(×40),血管壁胶原纤维丰富;G:模型组弹力纤维染色(×40),血管弹力板结构完整;H:模型组油红O染色(×40),血管内存在脂质沉积;I:TMAO组HE染色(×40),管腔可见明显斑块形成;J:TMAO组Masson染色(×40),纤维帽薄,斑块整体胶原纤维含量少;K:TMAO组弹力纤维染色(×40),弹力板破损,城墙样形态消失,部分断裂;L:TMAO组油红O染色(×40),斑块富含脂质,并形成脂质核心;M:TMAO抑制组HE染色(×40),血管内斑块形成,但体积较小;N:TMAO抑制组Masson染色(×40),斑块胶原纤维含量较多,纤维帽较厚;O:TMAO抑制组弹力纤维染色(×40),弹力板相对完整,形态轻度改变;P:TMAO抑制组油红O染色(×40),部分脂质沉积,未见脂质核心]

2.5 4组血管斑块面积及狭窄率对比

各组管腔面积差异无统计学意义(P>0.05)。对照组未见明显斑块形成,斑块面积及狭窄率与余各组差异均有统计学意义(P<0.05)。TMAO组斑块面积显著大于模型组、TMAO抑制组,差异有统计学意义(P<0.05),管腔平均狭窄率74.38%,均高于模型组与TMAO抑制组。模型组与TMAO抑制组组间斑块面积及狭窄率差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 各组间斑块面积、管腔面积及狭窄率对比

2.6 血清TMAO浓度与斑块狭窄程度的相关性

Pearson 相关分析结果显示,血清TMAO水平与管腔狭窄率呈正相关(r=0.61,P<0.01;图2)。

图2 血清TMAO浓度与狭窄程度的相关性分析

3 讨论

本研究以低温气体直接损伤血管内皮,模拟高血压、糖尿病、吸烟等心血管危险因素对血管内皮的损伤,并辅以高脂饮食,建立动脉粥样硬化斑块模型[5]。从病理切片上来看,除空白对照组外,均形成了动脉硬化斑块,说明造模成功。在本研究中,TMAO与 TG、HDL-C、LDL-C、TC等血脂指标无明显相关性,与刘振东等[6]研究一致。

TMAO促进了斑块的形成并增加不稳定性倾向。虽然内皮损伤后给予高脂饮食,均可大概率引起动脉硬化斑块形成,但TMAO组,因高胆碱饮食的干预引起TMAO水平的升高,斑块有着更大的脂质核心,而模型组及TMAO抑制组,脂质核心并不明显。目前研究发现,含有大脂质核心的斑块,易于破裂继发血栓形成导致血管阻塞,引起急性心血管事件[7]。同时,模型组及TMAO抑制组有着更厚的纤维帽,斑块内胶原纤维更为丰富。斑块肩部纤维帽受血管应力影响较大,若斑块纤维帽内胶原纤维缺乏,易导致纤维帽发生破裂[8]。弹力纤维显色中可以看到,TMAO组部分内弹力板破损,部分血管中膜弹力纤维被牵拉变直,血管中膜变薄,甚至中膜消失后内膜与外膜相接,展示了血管重构的一面,而模型组及TMAO抑制组血管整体结构基本未见显著被侵蚀改变,这种斑块更加稳定。TMAO促进斑块的不稳定性,可能与积极地参与了动脉粥样硬化过程中的各种生物反应相关。动物研究中发现,高浓度TMAO能通过ROS-TXNIP通路诱导TXNIP-NLRP3炎性体的活化,以剂量和事件依赖性的方式促进白介素-1β(IL-1β)的成熟和分泌,并且增加白介素-18(IL-18)等炎症因子的表达[9],从而引发炎症和免疫反应导致内皮损伤,并最终影响AS斑块的进展。同时也有实验证明,TMAO能通过NLRP3通路促进巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化,上调IL-1β、肿瘤破坏因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎症因子的表达[10],导致炎症细胞的募集、促进细胞外基质的降解、加重内皮细胞功能障碍,进而对AS的进展产生影响。此外,利用经TMAO诱导内皮祖细胞(EPCs)的实验证明了在TMAO能使EPCs上调IL-6、CRP、TNF-α、ROS以及减少了NO的产生[11]。TMAO还能通过促有丝分裂原活化的蛋白激酶和NF-kB信号加重炎症,下调抗炎因子白介素-10(IL-10)表达[12]。这些炎症因子表达的增加,加速了AS的形成和发展,并可促进急性斑块破裂事件的发生。因此,TMAO的过表达促进斑块炎症反应,可引起斑块结构不稳定,显著增加斑块破裂出血风险,引起急性心脑血管事件的发生。

通过斑块测量数据,本研究中3组间管腔面积未有明显差异,但TMAO组斑块面积及狭窄程度显著偏大,平均狭窄74.38%,远高于其余两组。斑块面积及狭窄程度很大程度上决定了患者的临床症状,同时,斑块负荷重的易损斑块更易出现破裂闭塞[13],增加急性心血管事件,并增加冠脉介入干预或冠脉搭桥手术治疗的风险。通过Pearson相关分析,发现斑块造成的管腔狭窄率与TMAO浓度存在正相关。可见,TMAO的过表达对斑块的形成及发展均有重要影响,斑块体积及管腔狭窄的增大均可显著增加临床冠脉血运重建治疗的机率。

因此,本研究结果显示肠道菌群代谢物TMAO对血脂并无显著性影响,但其表达增加后可促进动脉粥样硬化斑块的产生,并加重斑块内脂质沉积,增加狭窄程度,增加斑块的不稳定性并可能引起急性血栓事件,对其抑制后有改善作用。但本研究存在一定局限性,一是样本量偏小,统计可能有一定偏倚,二是TMAO影响动脉硬化斑块产生与发展的具体机制如何,本研究并未涉及。