PCBP1在原发性干燥综合征干眼患者泪液中的表达及其相关性

胡圣佳 俞萍萍 王新昌 陈慕芝 杨立

作者单位：浙江中医药大学附属第二医院眼科，杭州 310000

干燥综合征（Sjögren's syndrome，SS）是一种多因素的慢性系统性自身免疫性疾病，主要表现为泪腺及唾液腺受累导致的眼干及口干等症状[1]。若SS单独出现，称为原发性干燥综合征（Primary Sjögren's syndrome，PSS）；若SS继发于其他各类免疫系统疾病，如类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮等，则被称为继发性SS[2]。干眼症是SS的主要表现之一，其发生率为84.9%，通常作为首发症状先于SS在眼科确诊。目前国内外针对SS患者的调查研究显示，干眼是SS患者最影响生活质量的症状，严重限制其日常活动，社会劳动力下降，容易出现抑郁等心理障碍[3]。

干燥综合征相关干眼（Sjögren's syndrome dry eye diseasesm，SS-DED）患者的眼部表现主要有眼干涩、无泪和少泪、异物感、畏光、眼痒、疲劳感等[4]。SS-DED发病可能与泪液成分改变、泪膜稳定性不良、角膜上皮细胞异常、眼表炎症及免疫反应等因素有关[5]。目前临床上有许多治疗措施，如人工泪液补充、炎症控制、营养支持等，但由于其病因复杂，发病机制不明确，医师对此疾病的认识不足等原因，治疗效果往往不佳，甚至容易漏诊误诊。随着分子生物学和生物信息学等技术的发展，SS-DED发病机制的探究引起广大学者的兴趣，越来越多的基因或蛋白被发现和SS-DED的发生发展有关[6-7]。我们团队利用生物信息学技术对数据库中干眼患者和正常人的差异基因进行分析，寻找出显著差异基因多聚胞嘧啶结合蛋白1 [Poly(rC)-binding protein 1，PCBP1]。PCBP1是广泛存在于细胞内的RNA结合蛋白，在维持细胞内mRNA稳定、参与基因转录、翻译沉默与增强等方面有重要作用，此外，PCBP1还参与铁离子转运以及维持细胞内铁稳态平衡[8]。有研究发现，PCBP1与干眼的发病和发展密切相关，其上调可导致多种炎症因子的表达增加，导致眼表组织的炎症反应和机体应激反应增加，从而加剧了干眼症的病理变化[9]。因此我们团队拟通过收集和检测SS-DED患者的泪液进行验证和研究，探究PCBP1在SS-DED患者泪液中的表达情况及其与临床指标的相关性，为研究SSDED发生发展的分子机制奠定基础，为无创性诊断SS-DED提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 对象

纳入标准：（1）年龄为18～80岁，性别不限。充分理解本实验，自愿签署知情同意书，并按要求随访，完成试验流程者。（2）能独立完成干眼问卷调查。（3）就诊前未接受干眼相关治疗。（4）SS干眼组纳入标准：纳入我院风湿免疫科和眼科医师确诊的SS伴干眼的患者。具体SS的诊断采用2016国际SS标准工作小组ACR/EULAR提出的最新SS分类标准，当下列5项评分总和≥4分诊断为PSS，具体细则包括：①唇腺体病理活检示淋巴细胞灶≥1灶/4 mm2，计3分；②血清抗SSA抗体或抗SSB抗体阳性，计3分；③至少单眼Schirmer试验≤5 mm/5 min，计1分；④至少单眼结膜角膜染色（OSS法）≥5，计1分；⑤非刺激性全唾液流率（UWS）≤0.1 mL/15 min，计1分。干眼诊断标准：符合2020 年中国干眼专家共识[10]。（5）非SS干眼患者纳入标准：患者仅确诊为干眼，而不伴有PSS。（6）正常组纳入标准：均不患有干眼症和PSS的患者。

排除标准：（1）任何影响本试验观察的眼病及全身疾病者；（2）3 个月内曾行眼部手术者；（3）近1 个月配戴角膜接触镜者；（4）服用抗生素类药物、免疫抑制剂，或近2周使用抗生素类、激素类、人工泪液眼药水者；（5）合并有严重心脏、肝脏、肾脏功能不良者；（6）妊娠或哺乳期患者；（7）同时参与其他临床试验者；（8）SS需要全身用药患者或需要接受手术治疗的SS-DED患者；（9）研究者认为不适合参加研究的患者，包括不能或不愿意遵守方案要求者。

选取2023年7—10月于浙江中医药大学附属第二医院风湿免疫科、眼科确诊PSS伴干眼的患者6例（12眼，其中男2例，女4例）纳入PSS干眼组，年龄29～69（52.3±14.5）岁。选取同时期至医院体检的健康正常人6 例（12 眼，其中男2 例，女4 例）纳入正常组，年龄30～54（50.2±11.6）岁。选取非SS干眼患者6 例（12 眼，其中男2 例，女4 例）纳入非SS干眼组，年龄30～64（51.2±9.2）岁。本研究过程符合赫尔辛基宣言，且该研究已获得浙江中医药大学附属第二医院医学伦理学委员会的批准（批件号：2021-KL-152-01），所有患者均了解本研究过程并自愿签署知情同意书。

1.2 方法

检查均由同一位经验丰富的医师进行，检查按照先非侵入再侵入性的顺序进行。

1.2.1 眼表疾病指数问卷（Ocular surface disease index，OSDⅠ） 评估主观症状，包括近1 周内畏光、异物感、眼痛、视力波动等12项指标评分，每项0～4 分，OSDⅠ评分=所有得分总和×25/测评题目总数，总分为0～100分。OSDⅠ值为：0～12分为正常；＞12～22分为轻度干眼；＞22～32分为中度干眼；＞32～100分为重度干眼。

1.2.2 泪河高度（Tear meniscus height，TMH）测量 采用眼表综合分析仪（OCULUS Keratograph 5M，德国Oculus公司）红外光对患者下睑中央进行对焦后，切换白光快速拍摄后使用仪器测量。

1.2.3 非侵入式泪膜破裂时间（Noninvasive tear break-up timem，NⅠBUT） 采用眼表综合分析仪自动记录下首发破裂泪膜时间NⅠBUT（f）和平均泪膜破裂时间NⅠBUT（av），并显示泪膜破裂位置。

1.2.4 角膜荧光素染色（Corneal fluerescein staining，CFS） 将角膜分为4个象限，每个象限0～3分，评分标准为：0分：无染色；1分：1～30个点状着色（轻度）；2分：＞30个点状着色，未见到融合（中度）；3分：点状着色融合、丝状物及溃疡（重度）。

1.2.5 睑板腺缺失度评分（Meibomian gland loss，MGL） 0分无缺失，1分睑板腺缺失≤1/3，2分睑板腺缺失1/3～2/3，3分睑板腺缺失＞2/3，最后评分上下眼睑睑板腺的评分相加得到总分0～6分。

1.2.6 眼红指数（Ocular redness index，ORⅠ） 分为结膜等级和睫状等级，采用眼表综合分析仪自动评分。

1.2.7 Schirmer试验（SⅠt） 将检测的滤纸条（5 mm×35 mm）头端内折置入下眼睑外中1/3交界处的结膜囊，嘱受试者轻闭眼，测量5 min内泪液浸湿试纸的长度。

1.2.8 泪液采集与检测 采用滤纸法收集泪液，所有被检者均不行表面麻醉，嘱患者眼球转向鼻侧，暴露颞侧球结膜，将Schirmer试纸2 片各置于患眼下穹窿中外1/3 处，要求患者轻闭双眼，直至Schirmer试纸的湿润长度2眼相加达到30 mm，将吸有泪液的滤纸片立刻放入2 mL EP管中，离心后-80 ℃冰箱储存。RT-PCR检测PCBP1 基因表达，采用酶联免疫吸附试验方法（ELⅠSA） 测定泪液PCBP1水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书（标准品信息：PCBP1（Human） Recombinant Protein（Q01），Abnova，H00005093-Q01），并采用全波长酶标仪于450 nm波长下测定吸光度（Optical density，OD）值，并以标准曲线计算泪液样本中的PCBP1水平。

1.2.9 生信分析 数据来源于proteomeXchange:PXD012917，蛋白t-test差异表达fold-change≥1.5或≤0.67和q value≤0.05认为是显著差异蛋白，蛋白的标签利用PANTHER识别。采用KOBAS数据库进行GO/KEGG功能分析。

1.3 统计学方法

病例对照研究。采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，参数之间的相关性采用 Pearson相关分析，诊断价值采用受试者工作特征（Receiver operating characteristic，ROC）曲线分析，曲线下面积（Area under the cure，AUC）0.7～0.9表示具有一定的准确性，AUC＞0.9表示具有较高的准确性。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

3 组间年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 临床指标比较

3组患者OSDⅠ评分、ORⅠ、TMH、NⅠBUT（f）、NⅠBUT（av）、MGL、SⅠt、CFS的比较见表1。3 组间两两比较显示，OSDⅠ评分：正常组＜非SS干眼组＜SS干眼组，TMH、NⅠBUT（f）、NⅠBUT（av）、MGL、SⅠt指标：正常组＞非SS干眼组＞SS干眼组，差异有统计学意义（P＜0.05）。CFS:正常组＜非SS干眼组＜SS干眼组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。ORⅠ：非SS干眼组＜SS干眼组，正常组＜SS干眼组，差异有统计学意义（P=0.043、0.010）；正常组＜非SS干眼组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 生物信息学分析

2.3.1 生物信息学分析筛选特异性蛋白 我们利用生物信息学技术对数据库中干眼患者和正常人泪液中的差异蛋白进行统计学分析，寻找出有显著差异的蛋白。如图1 所示，筛选出190 种具有统计学意义的差异蛋白，在干眼患者泪液中表达上调。

表1.3组各临床指标比较Table 1.The comparison of clinical indicators of three groups

图1.干眼患者泪液蛋白差异性表达的火山图Figure 1.Volcano map of proteins differently expressed in tears of dry eye patients

2.3.2 GO富集分析 为了全面表征干眼症患者泪液中190种蛋白的差异表达情况，我们进行了GO和KEGG富集分析。从生物学过程、分子功能和细胞组分方面进行富集分析，如图2的GO富集分析显示，GO术语如有机氮化合物代谢过程，蛋白质代谢过程、物质运输、代谢调控过程、在细胞激活、防御反应、有机物反应、催化活性调节、白细胞介导的免疫反应等被列入富集最丰富的术语。

图2.干眼患者泪液差异蛋白的GO富集分析图Figure 2.GO enrichment analysis of tear differential protein of dry eye patients

2.3.3 KEGG富集分析 为了更好地了解生物学功能和相互作用，我们进一步进行了KEGG通路富集分析，筛选出164条富集通路，如图3的KEGG通路富集结果显示，这些差异表达的泪液基因可分为5个不同的功能群:代谢、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程、生物系统。其中在代谢群组中氨基酸生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、谷胱甘肽代谢和黏蛋白型O-聚糖生物合成均显著富集；在遗传信息处理群组中内质网的蛋白处理和蛋白酶体均显著富集。在环境信息加工群组中只有HⅠF-1信号通路有统计学意义上的富集。在细胞过程群组中铁死亡和细胞吞噬体显著富集。此外，生物系统组中的免疫系统显著富集。值得关注的是，我们发现在KEGG数据库中的164条富集通路中，铁死亡通路存在显著性差异表达，预测的通路蛋白有TF、GSS、PCBP1、CP，其中PCBP1的表达最为显著（图4）。

图3.干眼患者泪液差异蛋白的KEGG通路富集分析图Figure 3.KEGG pathway enrichment analysis of differential proteins in tears of dry eye patients

图4.干眼患者泪液差异基因表达散点图Figure 4.Scatter plot of differential gene expression in tears of dry eye patients

图5.3组患者泪液中PCBP1的RT-qPCR结果散点图n=18；a, P＜0.001。Figure 5.Scatter plot of RT-qPCR results of PCBP1 in tears of three groups of patients n=18; a, P＜0.001.

2.3.4 RT-qPCR验证泪液基因 为了验证我们的生信分析结果，我们选择了健康人群、干眼症患者、SS-DED患者，对3组患者进行泪液采集，通过qPCR验证基因TF、GSS、PCBP1、CP在3 组之间的差异表达。我们收集3组患者的泪液样本各6例，RT-qPCR结果显示TF、GSS、PCBP1、CP这4种基因均有差异性表达，但PCBP1的差异性表达最为显著，同时我们发现PCBP1表达量在SS-DED组中最高，证明了PCBP1在SS-DED患者的泪液样本中存在显著性差异表达（图5）。

2.3.5 ELⅠSA定量检测PCBP1 ELⅠSA定量测定泪液PCBP1结果如图6所示。3组泪液PCBP1水平比较，SS-DED组患者泪液PCBP1水平显著高于非SS干眼组和正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图6.ELISA定量检测PCBP1表达情况散点图n=18；a, P＜0.001。Figure 6.Scatter plot of quantitative detection of PCBP1 by ELISA n=18; a, P＜0.001.

2.3.6 PCBP1对干眼诊断的价值 ROC曲线分析显示，泪液PCBP1表达水平诊断SS干眼症的AUC为0.944，以ROC曲线靠左上方约登指数的最大切点作为最佳临界值，得到最大约登指数为0.817，最大阈值为1.201，此时灵敏度和特异度分别为0.956和0.861，说明PCBP1对诊断SS干眼症有很高的诊断价值（图7）。

图7.PCBP1诊断SS干眼症的ROC曲线Figure 7.ROC curve of PCBP1 in diagnosing SS-DED

2.3.7 PCBP1 表达水平与眼表功能的相关性分析 结果显示，PCBP1 表达水平与NⅠBUT（f）、NⅠBUT（av）、TMH、SⅠt呈负相关（r=-0.88、-0.91、-0.78、-0.82，P＜0.001）；PCBP1 表达水平与OSDⅠ评分、ORⅠ、MGL呈正相关（r=0.84、0.88、0.86，P＜0.001）。

3 讨论

PSS是一种系统性自身免疫类疾病，其主要特征是免疫细胞浸润并破坏各种外分泌腺体，影响机体其他各器官的系统功能。当该类疾病累及眼部时，进行性大量淋巴细胞浸润和激活形成的非感染性炎症造成泪腺的破坏，影响泪液分泌的质和量，引发干眼症[11]。Liew等[12]的研究结果表明，超过10%的干眼患者患有SS。SS的典型症状为眼干及口干，其发生率分别为84.9%及68.8%[13-14]。但与非SS干眼不同的是，SS-DED患者的角膜、结膜症状及体征往往更重，易导致角结膜炎症、角膜受损、丝状角膜炎、角膜溃疡甚至出穿孔，严重影响视力[15]。本研究数据显示，SS-DED患者泪膜稳定性更差，泪液分泌更少，睑板腺的形态状况更差，眼部的主观症状也更突出。这也符合目前国内外研究现状。

目前国内外对SS-DED的诊断主要依靠自身抗体检查、唇腺活检以及干眼检测的综合评判[13]。而干眼的诊断主要依据患者的主诉和眼部体征，但这些结果的准确性很大程度上受患者主观感觉和配合度的影响。庄宏和徐建江[16]的研究结果显示，干眼患者泪液的理化性质和蛋白组学分析结果与正常人相比存在明显差异，这一分析结果为干眼症提供了新的诊断依据。Potvin等[17]的研究结果表明，基质金属蛋白酶-9 在干眼症患者眼表中存在异常表达，使得基质金属蛋白酶-9的快速检测可成为干眼症诊断的新手段。但是，目前上述检查手段在临床上尚无统一的诊断标准，这使得寻找泪液中特异性的蛋白从而探究SS-DED发生发展的分子机制显得尤为重要，有助于辅助SS-DED的临床诊断及治疗。

我们团队通过生物信息学分析，对数据库中干眼病人和正常人的差异蛋白进行统计学分析，筛选出190种具有统计学意义的差异蛋白，为了全面表征干眼症患者190种蛋白的差异表达情况，我们进行了GO和KEGG富集分析，最终寻找出在铁死亡通路上有显著性差异表达的蛋白PCBP1。我们团队的研究显示PCBP1在SS-DED患者中表达量显著高于非SS干眼组人群和健康人群。进一步ROC曲线分析显示，PCBP1 泪液表达水平诊断SS干眼症的AUC为0.944，灵敏度和特异度分别为95.6%和86.1%，说明PCBP1对诊断SS干眼症有很高的诊断价值，或可成为新的SS-DED诊断标志物。

本研究对眼表临床数据与PCBP1 进一步做相关性分析，表明PCBP1在泪液中表达水平越高，泪膜稳定性越差，泪液分泌量越少，干眼主观症状越严重。其中ORⅠ、MGL与 PCBP1 呈正相关，表明PCBP1可能某一程度影响眼表的炎症状态，进一步影响睑板腺形态和功能，影响脂质分泌，进而导致泪膜稳定性下降。CFS与PCBP1无相关性，可能由于样本量较少引起。

PCBP1 是一种众所周知的RNA结合蛋白，其通过其多聚胞嘧啶结合能力参与多个基因调控过程，包括转录激活、RNA剪接、翻译增强或沉默以及运输过程[18-19]。PCBP1 可作为细胞内铁的分子伴侣，参与铁代谢，协助Fe2+转运至铁蛋白氧化为Fe3+状态存储，维持细胞内铁平衡[20]。PCBP1在肝脏[21]、肿瘤[22]、病毒感染[23]等领域密切相关。研究表明，在干眼症患者的角膜上皮细胞和结膜上皮细胞中，PCBP1的表达水平明显升高，提示其可能参与了干眼症的发病机制，具体分子机制尚不明确。同时有研究发现，在干眼病变中，角膜上皮细胞损伤和死亡与铁离子浓度异常有关。铁离子浓度异常会启动铁死亡信号通路，致使铁依赖的Fenton反应和Haber-Weiss反应被激活，引起干眼症的角膜上皮细胞死亡[24]。基于以上研究报道和实验结果，我们团队认为PCBP1 与SS-DED发生发展高度相关，可能通过PCBP1 介导的相关铁死亡通路影响SS-DED的发生发展，其具体机制有待进一步研究。

综上所述，PCBP1 参与SS-DED的发生发展，PCBP1 这一指标或可成为监测泪液成分改变和评估干眼程度更客观和敏感的生物学标志物，从新的角度阐释SS-DED的发病机制，为SS-DED的诊断及治疗提供新的思路。我们临床上对可疑PSS患者需行常规眼部检查，泪液收集和检测，从而早期发现PSS及其继发的眼表疾病，对其早期诊断并提供个体化治疗具有重要意义。

本研究的局限性在于：①即使本研究所有患者由同一医生操作，但由于实际工作中测量误差以及有些患者收集泪液时受到刺激后溢泪，可能影响检测结果准确性；②样本量少，后期还需增加泪液标本量，进行更全面的验证；③由于某些PSS患者泪液量极少，增加了样本检测难度，期待在未来检测手段的不断进步下，可实现微小泪液量的检测。

利益冲突申明 本文无任何利益冲突

作者贡献声明 胡圣佳：参与选题、设计及资料的分析和解释；采集数据；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。杨立：酝酿和设计实验；采集数据；修改论文中关键性结果、结论。俞萍萍：酝酿和设计实验；统计学分析；对文章的知识性内容做批评性审阅。王新昌：酝酿和设计实验；采集数据；提供经费支持。陈慕芝：采集数据；提供经费支持，行政、技术或材料支持