溴结构域蛋白4及其抑制剂在炎症性疾病中的研究进展

熊政翰,尹力,胡庆华

(中国药科大学药学院,江苏 南京 211198)

表观遗传(epigenetics)指DNA碱基序列不变而基因表达出现差异,其主要原因是DNA、RNA、组蛋白等遗传物质发生不同修饰,例如DNA甲基化、组蛋白甲基化和组蛋白乙酰化。其中组蛋白赖氨酸乙酰化是调节遗传信息表达的重要修饰,可促进转录因子与基因的结合,从而影响靶基因的转录活性[1]。

溴结构域(bromodomain,BD)是一类高度保守的蛋白结构域,长度约为110个氨基酸残基,可以特异性识别组蛋白以及转录因子上发生乙酰化的赖氨酸残基。目前在人类细胞中已鉴定出46种含有溴结构域的蛋白质,按结构的近似程度可分为8个家族[2]。其中第Ⅱ家族,溴结构域与超末端结构域(bromodomain and extra-terminal domain,BET)蛋白受到了最多的关注。BET蛋白家族包括4种蛋白亚型:溴结构域蛋2(BRD2)、BRD3、BRD4和BRDT,目前人们对BRD4进行了较为深入的挖掘,发现BRD4在基因转录、细胞周期等生命活动中扮演着重要的调控角色。

1 BRD4的生物学功能

BRD4在结构上包含2个串联的溴结构域(BD1以及 BD2)、超末端结构域(ET)和羧基末端结构域(CTD)[3],按照羧基末端氨基酸残基的长度可分为3种亚型:长亚型BRD4-L和短亚型BRD4-S(a)、BRD4-S(b)[4]。BRD4在功能上能特异性识别组蛋白或者转录因子上的乙酰化赖氨酸残基,通过影响染色质的结构或与转录因子发生作用,调节基因转录。CTD和BD2结构域可结合并招募正向转录延伸因子(P-TEFb)。当P-TEFb被BRD4招募至靶基因启动子或增强子位点后,RNA聚合酶Ⅱ发生磷酸化,从而促进下游基因的转录[5-6];ET结构域可结合组蛋白精氨酸去甲基酶6、染色质解旋酶DNA结合蛋白4、组蛋白甲基转移酶[7-8],通过调节染色质的状态从而改变基因的转录活性;BD1和BD2结构域可结合NF-κB RelA亚基310位乙酰化赖氨酸,进一步增强 NF-κB的转录激活作用,共同促进下游炎症基因表达[9]。

BRD4在人体组织中分布广泛。在神经组织中,少突胶质细胞以及神经元内BRD4蛋白与神经炎症存在关联[10];在肝脏中BRD4表达水平异常升高,参与肝脏炎症和纤维化的进程[11];在心脏中BRD4高表达,在炎症引发的心脏损伤中发挥重要调控作用[12]。此外,在不同肿瘤组织中,BRD4表达存在异常,研究证明BRD4与肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、白血病等癌症密切相关,被认为是癌症治疗潜在的靶点[13-18]。由此可见,广泛分布的BRD4与机体各项生命活动息息相关,抑制BRD4有望成为治疗各种疾病的重要策略。

2 BRD4抑制剂的研发现状

BET蛋白最初于癌症领域被发现,因此各种具有抗癌活性的BET小分子抑制剂率先涌现出来。Filippakopoulos等[19]于2010年报道的BET抑制剂JQ1,能竞争性抑制BRD4与染色质的结合,对睾丸核蛋白中线癌具有潜在治疗作用。随后出现了更多的BET抑制剂,其中一部分如AZD5153、CPI-0610、MK-8628已进入临床试验阶段,但适应证主要集中于抗癌抗肿瘤领域。随着对BRD4抑制剂的研究深入,研究者逐渐将目光从肿瘤领域汇聚到非肿瘤领域,探究BRD4抑制剂在抗炎和免疫领域是否能发挥新的作用。Resverlogix公司开发的RVX-208是一类口服BET抑制剂,通过调节载脂蛋白A-Ⅰ、高密度脂蛋白代谢影响体内胆固醇运输,主要用于急性冠状动脉综合证、动脉粥样硬化的治疗,目前已完成临床Ⅲ期试验[20]。而多数BRD4抑制剂在炎症疾病领域尚处于临床前研究阶段。JQ1作为最常用的工具药,在炎症疾病中初步展现出较好的潜在效果,这提示着BRD4抑制剂在炎症疾病治疗中具有独特的、广阔的应用前景。

3 BRD4抑制剂在炎症疾病中的作用

3.1 BRD4及其抑制剂与肾纤维化肾纤维化(renal fibrosis)指肾实质内出现不可逆的瘢痕沉积,是各种慢性进行性肾脏炎症疾病的共同发展方向[21]。肾脏内的瘢痕沉积致使器官结构受损、血液供应不足,最终导致肾功能丧失,造成肾衰竭以及尿毒症。而BRD4在人类纤维化肾组织中高表达,通过响应由于氧化应激、代谢紊乱、炎症因子和体内毒素等多因素造成的表观遗传修饰促进肾纤维化[22]。研究表明,抑制BRD4可以有效缓解肾纤维化。Wang等[23]发现,JQ1降低小鼠肾脏中α平滑肌肌动蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白的表达,抑制上皮-间质转化从而缓解血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠肾纤维化。此外JQ1还能降低肾组织中Smad3和ERK1/2磷酸化水平,抑制下游Nox4转录进而降低Nox4介导的ROS生成和肾纤维化[24]。

除了经典的JQ1,一些结构优化的BRD4小分子抑制剂也表现出较好的药效。Xiong等[25]发现,I-BET151下调肾脏BRD4、c-Myc和P53的表达,降低表皮生长因子受体和血小板生长因子受体磷酸化水平,通过Smad-3、STAT3和NF-κB信号通路抑制肾成纤维细胞活化、减少巨噬细胞浸润,减少G2/M期肾上皮细胞比例,最终改善单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾纤维化。Tao等[26]报道了一种新型BRD4抑制性先导化合物ZLD2218,通过减少BRD4表达、抑制Smad-3信号通路减少细胞外基质蛋白的沉积,有效改善小鼠肾脏纤维化。

3.2 BRD4及其抑制剂与哮喘哮喘(asthma)是一种慢性气道炎症,临床症状主要有胸闷、咳嗽和呼吸困难。其病因较为复杂,目前主流观点认为免疫系统紊乱和气道高反应性与哮喘发病关系紧密。气道高反应性指呼吸道对非抗原性刺激敏感性增加,支气管平滑肌出现过度的收缩反应,从而引起气道狙窄与气道阻力增加。研究表明BRD4参与了PM2.5诱发的小鼠气道高反应性反应[27]。Tian等[28]报道,两种新型BRD4抑制剂ZL0420和ZL0454能缓解TLR3激动剂诱发的气道高反应性、抑制肺纤维化和慢性气道重塑。其机制是通过介导TGF-β信号减少气道上皮细胞间充质转化,抑制肌成纤维细胞群的扩增与分化,降低分泌到胞外基质的胶原蛋白COL1A、纤连蛋白FN1的水平。

BRD4参与的免疫功能紊乱是哮喘的另一个重要病因,气道组织中的BRD4可以响应TLR信号,激活NF-κB/RelA等通路,通过激活先天炎症反应、募集中性粒细胞、促进间充质转化和肌成纤维细胞扩张从而引发哮喘[29-30]。Kerscher等[31]发现I-BET151可以降低T-细胞可诱导共刺激分子(ICOS)、细胞间黏附分子1(ICAM1)以及CD40 配体(CD40L/CD154)的水平,有效抑制人2型固有淋巴细胞ILC2细胞激活和2型免疫反应,从而有效降低肺部炎症和气道阻力。Perry等[32]发现JQ1和I-BET762可以抑制气道平滑肌细胞增殖,降低IL-6和CXCL8水平改善哮喘。Kaneshita等[33]报道了一种以喹啉酮结构为基础的BET 抑制剂CG223,通过转化生长因子β1(TGF-β1)途径,以剂量依赖的方式降低促纤维化基因Thbs1、Itgb3的转录激活,从而有效减少了肺部炎性细胞浸润。

3.3 BRD4及其抑制剂与肠道炎症炎症性肠病(IBD)是肠道的慢性复发性炎症,在临床上主要分为两种亚型,即溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。其病因较为复杂,肠道免疫系统紊乱是重要发病原因之一。肠道黏膜中免疫细胞过度活化会产生高水平的炎性细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-17),可进一步加剧肠道炎症和组织损伤[34-35]。而BRD4参与调节1、2以及17型炎症细胞反应,且在人类IBD患者中检测到BRD4 激活标记物 H3K122Ac丰度显著上调,提示BRD4在IBD中发挥重要的作用[36-37]。Cheung等[38]报道一种BRD4-BD1结构域选择性抑制剂MS402能够特异性抑制结肠组织Th17细胞的分化,通过减少BRD4募集p-TEFb,阻碍RNA聚合酶Ⅱ对Th17细胞分化相关基因的转录,下调IL-17、IL-21、IL-22、Rorc、T-bet水平,阻断Th17细胞过度发育从而预防和改善小鼠T细胞转移诱导的结肠炎。

3.4 BRD4及其抑制剂与皮肤炎症银屑病(psoriasis)是一种慢性皮肤炎症,其病理学表现为表皮基底层角化过度、真皮层毛细血管增生、炎性细胞浸润,临床表现为斑块、鳞屑等[39]。辅助性T细胞17(Th17)是一类重要的CD4+T淋巴细胞亚群,大量报道显示Th17在IBD病程中扮演关键角色。有研究者对银屑病患者血清细胞因子进行检测,其中 Th17细胞相关细胞因子(IL-17、IL-22)水平均显著高于健康受试者,而调控 IL-17对银屑病有很好的保护作用[40]。由此可见,抑制Th17细胞的增殖及分化,是治疗银屑病的重要方向。2015年Nadeem等[41]研究了JQ1在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病模型中的作用,发现JQ1有效抑制了Th17细胞分化所必须的转录因子视黄酸受体相关的孤儿受体C(RORC)的表达,通过调节RORC/IL-17A/IL-22途径有效减轻IMQ诱导的小鼠银屑病皮肤炎症。基于上述研究,Sato等[42]从一种ERK5-BRD4双重抑制剂的结构基础出发,设计出一种新型高抑制活性的BRD4抑制剂,在IMQ诱导的小鼠银屑病模型中展现出较好的疗效。

3.5 BRD4及其抑制剂与其他炎症性疾病类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)属于自身免疫性关节炎症,其发病与关节滑膜组织中成纤维样滑膜细胞(FLS)相关。Xiao等[43]发现JQ1可以抑制FLS增殖,下调炎性细胞因子产生和基质金属蛋白酶表达,通过抑制IκB激酶介导的NF-κB信号通路改善RA。Krishna等[44]进一步表明,RA患者来源FLS细胞内BRD2、BRD4水平显著上升,JQ1能显著抑制RA-FLS细胞炎性基因的转录激活,且发现BRD2和BRD4在基因转录过程中占据染色质不同区域并执行互不重叠的功能,这提示着JQ1通过靶向多条信号通路缓解RA。还有报道显示,BET抑制剂I-BET151降低RA-FLS细胞IL-6、IL-8表达,调节FLS细胞的增殖与炎症反应[45-46]。痛风(gout)是一种炎症性关节炎,主要病理现象是关节内发生单钠尿酸盐晶体沉积。一种针对BRD4 BD1结构域的选择性抑制剂LT052能有效减缓痛风大鼠模型滑膜组织中BRD4上调、NF-κB p65磷酸化水平增加,抑制NLRP3炎症小体激活和IL-1β释放,通过介导BRD4/NF-κB/NLRP3通路抑制巨噬细胞焦亡[47]。骨关节炎(OA)是关节发生的一种退行性病变,越来越多的证据表明OA病程中包括炎症部分。Jiang等[48]检测到BRD4在OA小鼠关节软骨中表达上调,ChIP分析表明高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是BRD4的一个直接作用靶点,JQ1通过降低BRD4介导的HMGB1转录激活,抑制NF-κB信号通路,进而缓解OA小鼠软骨细胞炎症与损伤。

除了关节软骨,BRD4在牙骨的炎症反应中同样发挥作用。牙周炎(periodontitis)是一种由细菌引发的炎症性口腔疾病,随着疾病的发展牙周支持组织受损,进而造成牙齿松动与脱落。Meng等[49]发现JQ1对实验性牙周炎小鼠模型具有缓解作用。其机制是JQ1降低牙周炎病变组织中Toll样受体和炎症因子的表达,并能下调由RANKL诱导的破骨细胞标志物水平。BRD4抑制剂还能通过作用于非骨质细胞对牙周炎起到保护作用,Maksylewicz等[50]研究了与牙周炎发病相关的牙龈上皮细胞和成纤维细胞,发现BRD4抑制剂I-BET151和JQ1均显著降低上述两种细胞由于牙龈卟啉单胞菌诱导的趋化因子、促炎细胞因子和基质金属蛋白酶水平,进一步扩充BET抑制剂治疗口腔炎症的作用机理。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种慢性肝病,其特征是肝脏组织中脂肪异常积聚,同时伴随有炎症和肝细胞损伤[51]。Middleton等[52]发现I-BET151通过调节干扰素信号改善小鼠NASH病症;Fu等[53]开发出一种BRD4小分子抑制化合物Compound 38,通过JAK-STAT以及MAPK信号通路抑制肝巨噬细胞激活,同时还影响TGF-β/SMAD通路和Wnt/β-Catenin通路减轻肝脏炎症和纤维化。急性肝损伤(ALI)是由药物、外来病菌、体内代谢等多因素引发的肝功能障碍和炎症反应,Chen等[54]报道了一种具有四环结构骨架的BRD4抑制化合物Compound 28,在肝损伤模型中降低了TNF-α、IL- 1β和IL-6的水平,已初步展现出较好的抗炎活性和对肝损伤的保护作用。

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性血管炎症,病理特征为动脉壁中脂质沉积物和胆固醇积累形成斑块,造成血管狭窄甚至闭塞。AS的病程中血管内皮细胞发挥了重要作用:在高胆固醇、高血压、吸烟等诱因下,血管内皮细胞出现损伤从而导致功能异常,产生一氧化氮减少、表达黏附分子、趋化因子增多,吸引白细胞在血管内壁附着,进一步加剧炎症和脂质积累。Brown等[55]发现JQI抑制了BRD4介导的血管内皮细胞内NF-κB的核易位,降低黏附分子E-选择素、血管细胞黏附分子以及趋化因子CCL2的转录,有效减少血管内斑块生成。另一种BRD4抑制剂RVX-208对小鼠血管炎症和动脉粥样硬化具有较好保护作用,目前已进入临床试验阶段[56-57]。

脓毒血症是一种由细菌感染引起的严重疾病,特征是体内存在大量细菌毒素累积,进而引发全身炎症反应。细胞因子风暴是脓毒血症的发病机制之一[58], Belkina等[59]发现JQ1降低脓毒血症小鼠体内IL-6和TNF-α的水平从而缓解炎症反应;RVX-297是一种口服BET抑制剂,能选择性抑制BD2结构域。Jahagirdar等[60]发现RVX-297显著降低脓毒血症小鼠体内炎性因子IL-6、IL-17、IFN-γ以及促炎蛋白MCP-1、MCP-5的水平。此外脓毒血症还导致机体出现其他严重并发症,如脓毒症相关脑病。Zhong等[61]发现JQ1能通过NF-κB通路抑制脓毒性脑病小鼠海马神经元细胞的焦亡,从而有利于保护血脑屏障、减轻神经炎症。

4 总结与展望

BRD4及其抑制剂在炎症性疾病中的研究进展表明,BRD4是一种重要的表观遗传调控因子,可以通过影响多种炎症相关基因的表达,参与炎症反应的发生和发展。BRD4抑制剂可以有效地抑制BRD4介导的基因转录,从而抑制炎症反应,改善组织损伤和功能障碍。然而,BRD4抑制剂也存在一些局限和挑战,如BRD4抑制剂的非特异性、不良反应、耐药性等。因此,需要开发更具特异性、安全性和稳定性的BRD4抑制剂,以提高其治疗效果和减少其副作用。此外,还需要探索BRD4抑制剂与其他药物的联合治疗效果,以增强其抗炎作用或克服其耐药性。最后,还可以利用新型技术(如PROTACs)降解BRD4蛋白,从而实现更强的和更持久的BRD4抑制效果。总之,BRD4及其抑制剂在炎症性疾病中具有广阔的应用前景,值得进一步的研究和开发。