UPLC-Q-Orbitrap-MS快速分析水红花子的化学成分

边星,夏林波,邓仕任,孙璐,杨浩

(辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600)

水红花子为蓼科(Polygonaceae)蓼属植物红蓼(PolygounumorientaleL.)的干燥成熟果实,别名水荭子、荭草实,性寒、味咸,具有散血消淤、消积止痛之功能,自1977年以来收载于历版《中国药典》中,为临床常用中药[1]。目前,已从水红花子中鉴定出40余种化学成分[2-4],主要集中在黄酮类(如花旗松素、槲皮素、荭草素等)、酰胺类(对香豆酰酪胺、对阿魏酰酪胺等)、鞣质类(二甲基鞣花酸、没食子酸等)、脂肪酸类(亚油酸、壬酸等),但对水红花子化学成分的系统研究尚显不足,有必要对水红花子开展全面的成分分析研究。超高效液相串联四极杆静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Orbitrap-MS)技术具有高灵敏度、高通用性及高分辨率的特点,已经成为中药复杂成分分析研究中强有力的工具,已广泛用于中药成分定性分析[5]。本研究旨在采用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术对水红花子提取物的化学成分进行全面深入的分析,为阐明水红花子的药效物质基础提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器QExactive plus四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Ultimate 3000超高效液相色谱系统(美国Dionex公司);数据处理系统为Xcalibur 4.1工作站(美国Thermo Fisher Scientific公司);ME 204E十万分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-3000E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Direct-Q5型超纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 试药水红花子购买自亳州典世堂药业销售有限公司,由辽宁中医药大学王添敏教授鉴定为蓼科植物红蓼(PolygonumonrientaleL.)的干燥成熟果实,标本存放于辽宁中医药大学药学院。阿魏酸、槲皮素、芦丁、小檗碱等对照品购自四川维克奇生物科技有限公司,纯度均大于98.5%。甲醇和乙腈为色谱纯;甲酸为质谱纯(美国Tedia公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 试验方法

2.1 供试品溶液的制备水红花子药材干燥后粉碎,精密称取粉末(过三号筛)1.00 g,加甲醇10 mL,浸泡1 h,再超声提取(功率 250 W,频率40 kHz)1 h,放冷,提取液4 000 r·min-1离心10 min,取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.2 对照品溶液的制备取阿魏酸、槲皮素、芦丁、小檗碱对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1 mL各含 5 μg的混合溶液,即得。

2.3 色谱条件色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流动相:A相为含0.1%的甲酸水,B相为含0.1%的甲酸乙腈。梯度洗脱条件:0～1 min,1% B;1～20 min,1% B→99% B;20～21 min,99% B。柱温:40 ℃,流速:0.2 mL·min-1,进样量:3 μL。

2.4 质谱条件HESI离子源;离子源温度:200 ℃;正、负离子扫描模式;电离源电压4 KV;毛细管温度320 ℃;透镜电压110 V;鞘气和辅助气为高纯氮气(纯度>99.99%),鞘气流速40 arb,辅助气流速10 arb;MS1为全扫描模式,扫描范围:50～1 250 m/z,分辨率:60 000;MS2采用数据依赖性扫描(DDA),选择MS1中最强10个离子进行扫描;裂解方式:CID;裂解能量:35 eV。

3 结果

在“2.3”和“2.4”项下的检测条件下,得到水红花子甲醇提取物正、负离子模式下的基峰图(见图1)。通过Xcalibur 4.1软件查看质谱数据,结合相关文献、质谱库数据和标准品的对比分析,共从水红花子中鉴定出54个化学成分,详细信息见表1。结果表明,水红花子成分复杂,种类较多,鉴定出的成分包括21个黄酮(黄酮醇)及其糖苷、6个酚酸、5个氨基酸、4个生物碱、4个脂肪酸及其酯、3个二氢黄酮、3个核苷、3个鞣质和5个其他类成分。

表1 水红花子的UPLC-Q-Orbitrap-MS鉴定结果

A.为正离子模式;B.为负离子模式

其中,小檗碱、四氢帕马丁、甜橙黄酮、5-O-去甲川陈皮素、3-O-对香豆酰基奎宁酸、黑麦草内酯、酪氨酸、L-焦谷氨酸、异亮氨酸、犬尿酸、腺苷、鸟苷、壬二酸、壬二酸单甘油酯、2-亚麻酰基-rac-甘油等15种化合物为首次从水红花子中鉴定得到。

3.1 黄酮苷类同分异构体的鉴定水红花子中富含黄酮碳苷和黄酮氧苷等两类黄酮单糖苷,其中有多组同分异构体。借助于Orbitrap高分辨的二级质谱数据,可以根据离子裂解特征对上述同分异构体进行区分。负离子模式下,黄酮碳苷主要通过糖基的环裂解产生一系列稳定的特征二级离子碎片,如[M-H-120 Da]-和[M-H-90 Da]-等,而黄酮氧苷则易通过糖基的整体丢失形成相应的苷元基峰碎片,如[M-H-146 Da]-等[8-10]。以化合物14、16、26为例介绍其鉴定过程。一级质谱中,3个化合物[M+H]+均为449.105,[M-H]-均为447.092,推断分子式均为C21H20O11,为同分异构体。负离子模式下,化合物14的二级质谱[如图2(A)]所示,其中丰度最强的碎片离子为m/z 357.061 7([M-H-90 Da]-),碎片特点符合碳苷己糖六元环0,3键开环裂解,为丢失C3H6O3后所产生的稳定的[0,3X0-H]-离子,此外还可见碎片离子m/z 327.051 2([M-H-120 Da]-),429.083 0([M-H-18 Da]-),285.040 7([M-H-162 Da]-),分别对应为[0,2X0-H]-、[M-H-H2O]-和[M-H-Glc]-离子。上述二级质谱信息与黄酮己糖碳苷的裂解规律相符,结合文献报道推断化合物14为“异荭草素”。化合物26的二级质谱[如图2(B)所示]与化合物14的完全不同:该化合物主要产生m/z 301.035 1([M-Glc]-)和300.0285([M-H-Glc]-·)两种碎片离子,符合黄酮己糖氧苷的Y裂解(即脱去糖基而保留羟基)方式[11-12],结合文献报道推断化合物26为“槲皮苷”。化合物14和26的质谱裂解途径如图2所示。值得一提的是,化合物16的二级质谱与化合物14的十分类似,二者间的区别仅为化合物16中m/z 429.083 0([M-H-H2O]-)碎片的相对丰度较低(约为化合物14的1/5),由此推断化合物16中的己糖存在于C-8位[10,13],化合物16鉴定为“荭草素”。

A.为异荭草素;B.为槲皮苷

3.2 多甲氧基黄酮的鉴定从水红花子提取物中共鉴定出9种多甲氧基黄酮,该类化合物为水红花子的特征药效成分。多甲氧基黄酮易在正离子模式下检测,在二级质谱中常丢失一个到多个CH3·,产生一系列[M+H-15n]+的强峰,同时还伴随着C=O和H2O的中性丢失。现以化合物49为例介绍鉴定过程。一级质谱中,该化合物的[M+H]+为463.156 8,推断分子式为C23H26O10。二级质谱中,可以观察到碎片离子m/z 448.136 6([M+H-15]+)、433.113 3([M+H-15-15]+)、430.127 4([M+H-15-18]+)、402.131 8([M+H-15-18-28]+)、415.103 5([M+H-15-15-18]+),为母离子经一系列脱甲基、脱水、脱羰基之后产生的碎片峰,符合多甲氧基黄酮的质谱裂解规律[14]。经与文献数据比对确定化合物49为“exoticin”,一种八甲氧基黄酮,其二级质谱图及可能的裂解过程见图3。

图3 Exoticin的二级质谱和质谱裂解途径

3.3 小檗碱的鉴定本文从水红花子中首次鉴定出小檗碱、四氢帕马丁、甜橙黄酮、5-O-去甲川陈皮素等15种化学成分,均是通过与MassBank、mzCloud等质谱数据库或对照品相比对而指认的,下面以化合物35为例进行介绍。一级质谱中,该化合物的[M]+为366.121 6,推断分子式为C20H18NO4+。二级质谱中,可以观察到碎片离子m/z 321.099 5([M-15]+ ·)、306.076 5([M-15-15]+),为母离子分别丢失一个和两个甲基所产生的碎片离子,同时还可以观察到m/z 320.092 3([M-15-1]+·)、292.097 1([M-15-1-28]+),为[M-CH3]+·经一系列脱氢、脱羰基所形成[15]。经与MZCloud数据库和对照品比对确定化合物35为小檗碱,其二级质谱图及可能的裂解过程见图4。

A.为样品;B.为对照品

4 讨论

本文利用UPLC-Q-Orbitrap-MS技术对水红花子提取物中的化学成分进行鉴定,共鉴定出包括黄酮类、酚酸类、生物碱类等54种化学成分,其中小檗碱、四氢帕马丁、甜橙黄酮、5-O-去甲川陈皮素、3-O-对香豆酰基奎宁酸、黑麦草内酯、酪氨酸、L-焦谷氨酸、异亮氨酸、犬尿酸、腺苷、鸟苷、壬二酸、壬二酸单甘油酯、2-亚麻酰基-rac-甘油等15种成分为首次从水红花子中鉴定得到,也是首次从药用植物红蓼中鉴定得到。本文以异荭草素、荭草素、槲皮苷的鉴定过程为例,阐述了同分异构体的质谱解析过程;以小檗碱为例描述了新发现化合物的鉴定方法;还首次报道了水红花子中的特征性成分-exoticin(1种八甲氧基黄酮)的质谱裂解规律。上述结果表明,Orbitrap技术具有超高质谱分辨率和超高质量精度的优势,可以快速可靠地识别和鉴定多种化合物,适用于中药等复杂体系中的化学成分分析研究。本研究可为水红花子的药效物质基础研究提供依据。