太子参脱毒苗培养、化学成分及指纹图谱研究进展

郭慧慧,蒋元斌,林丛发,徐绍翔,林泽宇,薛立云

(1.宁德市农业科学研究所,福建 宁德 355017;2.福安市康厝乡乡村振兴服务中心,福建 宁德 355007)

太子参系双子叶石竹科孩儿参属植物[Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Paxex Pax et Hoffm]的干燥块根,呈细长纺锤形或细长条形,表面灰黄色至黄棕色,味甘、性平、微苦,归脾、肺经[1]。经现代药理学研究,太子参含有糖类、环肽类、微量元素、苷类、氨基酸类等多种化学成分,这些化学成分具有增强记忆、免疫调节、抗白色念珠菌、抑制食管癌、降血糖、促血管新生等多方面的药理活性。2002年太子参被国家批准列入可食用保健食品物品名单[2]。太子参功效逐渐被大众肯定,多地大力推广人工栽培,建设太子参GAP基地。但随着太子参栽培地区扩大及流通品系增多,亦出现了一些问题,如太子参病毒病呈逐年加重趋势,严重时导致优质太子参品种退化[3];品种混乱、内在质量参差不齐等。针对这些问题,学者们对太子参脱毒苗培养、化学成分及指纹图谱等方面开展了深入研究。本文就其脱毒苗研究、化学成分研究及指纹图谱研究报道予以综述,以期为太子参的进一步研究和开发提供理论依据。

1 太子参脱毒苗研究

1.1 茎尖生长点剥取脱毒茎尖脱毒原理是利用病毒在植株体内分布的不均匀性,即成熟器官中含量较高,幼嫩器官和茎尖分生组织中含量较少或不含病毒[4]。通常剥取的茎尖大小小于0.5 mm。关于太子参茎尖脱毒技术学者们关注点集中在茎尖诱导培养基的优化上,统计如表1。

表1 太子参茎尖诱导培养基

1.2 种胚剥取脱毒种胚剥取脱毒的原理是太子参种子繁殖不传播病毒。叶祖云等[8]的研究表明剥去种皮和外胚乳的太子参裸胚在培养基MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA中能很快被诱导萌发生长,萌发率78.3%。张博等[9]的研究表明太子参种胚在MS+0.1 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1KT+4.0 mg·L-12,4-D培养基下愈伤组织诱导率为96.11%,形成的愈伤组织在MS+2.0 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1NAA培养基中分化率达100%,分化出的幼苗壮实且多。

1.3 超低温脱毒超低温脱毒的原理是顶端分生组织细胞不含病毒且具有细胞核大、液泡小的结构特点,经超低温处理后,顶端分生组织细胞能存活,而其他细胞都会被冻死,病毒亦随之脱除[10]。与传统的茎尖脱毒相比,超低温脱毒具有对所取茎尖大小没有严格要求及降低了操作难度的优点。戴军等[11]采用超低温处理1 h,太子参脱毒率可达90%以上。具体如下:取经过表明消毒的1～1.5 mm幼芽接种到MS+140 g·L-1蔗糖固体培养基上预培养2 d,转入MS+140 g·L-1液体固体培养基0 ℃处理40 min,取出茎尖置于冷冻管,迅速丢入液氮保存1 h,随后取出置于40 ℃水浴解冻1.5 min,即可转入芽诱导培养基。赵云青等[12]亦采用超低温脱除太子参蚕豆萎蔫病毒。具体如下:1～2 mm茎尖接种于MS+0.3 mol·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂中4 ℃暗培养1～3 d,随后将茎尖放入加载液,室温下加载20～40 min,加载过的茎尖转移到PVS2溶液中(冰上操作,处理30～50 min),接着在铝箔盒中制作茎尖液滴,制作好后投入液氮处理30 min,再立即进行40 ℃水浴化冻处理0.2～1.5 min,0 ℃冰水混合物处理10 min,投入卸载液20 min,最后取出茎尖0 ℃暗培养5～7 d,弱光培养1个月可获得再生植株。

1.4 热处理脱毒热处理脱毒的原理是高温可使病毒蛋白变性而失去活性,而寄主植物与病毒耐高温程度不同,筛选适合的温度即可达到脱毒的目的[13]。朱艳等[14]的研究表明热处理结合茎尖法脱毒,脱毒率高达100%。具体如下:取茎尖分生组织诱导的已分化出3～4片叶的组培苗,转接于MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA培养基上,38 ℃、1 000 lx下连续培养30 d。

2 化学成分研究

太子参主要含糖类、环肽类、微量元素、苷类、氨基酸类、挥发油类、甾醇类、酚类、油脂类、生物碱类、磷脂类等多种化学成分[15-17]。以往的文献已对太子参化学成分进行了详细的归纳和总结,但鲜有太子参单一化学成分的药理活性及其合成影响因素的总结报道。近年来学者们对太子参化学成分药理活性的探讨主要集中在太子参多糖和太子参环肽B上。下文将对太子参多糖和环肽B的药理活性及其含量影响因素进行归纳总结。

2.1 太子参多糖太子参多糖的相对分子质量为3.0～212.0 kDa,主要由葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等单糖组成[18]。目前太子参多糖的提取主要有以下5种方法[19-24]:①水提醇沉法;②超声提取法;③超高压技术提取法;④蒸汽爆破技术提取法;⑤酶提取法。以上方法各有优缺点,大规模生产建议使用水提醇沉法或酶提取法。检测方法通常采用苯酚-硫酸法,以葡萄糖计多糖得率。现代药理研究表明太子参多糖具有以下生物活性。

2.1.1 免疫调节作用谢美林等[25]的研究表明太子参多糖对LPS(脂多糖)诱导损伤的Raw 264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)巨噬细胞有保护作用,表现为提高细胞存活率及改善细胞形态。乔石等[26-30]的研究表明太子参多糖对环磷酰胺(CY)造成的免疫抑制小鼠具有提高其免疫功能作用,具体表现为注射太子参多糖的小鼠免疫球蛋白 IgA、IgG、IgM 和细胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ的含量显著升高,改善因 CY 所致小鼠脾脏T淋巴细胞亚群数量的降低,调节小鼠脾细胞因子及转录因子mRNA的转录水平,降低脾淋巴细胞的凋亡。曾丽等[31]的研究表明,太子参多糖能在一定程度上提高小鼠脾淋巴细胞的增殖水平、NK细胞杀伤活性,调节相关细胞因子、转录因子的转录水平等,从而能在一定程度上提高小鼠对抗原卵清白蛋白的免疫应答能力,表现出一定的佐剂作用。

2.1.2 降糖作用Liu等[32]的研究表明太子参多糖可通过抑制2型糖尿病大鼠空肠RORγ蛋白的表达和增加Foxp3蛋白,进而恢复STZ诱导的T辅助因子17(Th17)和调节性T细胞(Treg)细胞失衡,从而维持肠道免疫稳态。王林莉等[33]的研究表太子参多糖具有促进高血糖大鼠足溃疡创面愈合的药效。徐先祥等[34]的研究表明太子参多糖能明显改善糖尿病小鼠抗氧化功能,保护胰腺。

2.1.3 其他作用Yang等[35]的研究表明太子参多糖可通过被动扩散及网格蛋白介导的内吞途径进入Caco-2细胞。Pu等[36]的研究表明太子参多糖可将M2巨噬细胞转换为M1型,从而在体外促进肿瘤细胞凋亡;作用机制为太子参多糖PHP-1被TLR4受体识别,促进Ca2+释放,并激活NF-κB和MAPK信号通路以重置M2型巨噬细胞。此外太子参多糖还具有改善记忆、保护心肌等[37-38]作用。

2.2 太子参环肽B太子参环肽B是一种环状八肽,由肽键和8个L-氨基酸[cyclo-(gly-gly-leu-pro-pro-pro-ile-phe)]组成的单环[39]。与其他植物环肽相比,具有在植物体中含量大、结构明确、原植物易得等特点。Morita等[40]的研究表明太子参环肽B是由核糖体合成和翻译后修饰肽(RiPP)衍生自前体基因prePhHB编码的前体肽,环肽B的核心肽序列是太子参中的IFGGLPP。目前对太子参环肽B的提取主要有以下3种方法:①甲醇提取法[41];②乙酸乙酯提取法[42];③乙醇热回流提取[43]。其中最常用的是甲醇提取法,检测方法通常采用高效液相色谱法。现代药理研究表明太子参环肽B具有以下生物活性。

2.2.1 增强记忆作用杨志友等[44]的研究表明太子参环肽B可促进大脑皮层神经元突起再生,保护Aβ诱导的皮层神经元丢失和突起萎缩;增强注射Aβ-42的阿尔茨海默病(AD)小鼠的记忆恢复,并可调节脾脏辅助性T细胞,改善神经炎症[45];增加海马中HT的5个水平,减少前额叶皮层和海马中多巴胺、二羟苯乙酸和高香草酸的代谢产物,可用于制备防治老年痴呆症的药品或保健食品[46]。

2.2.2 抗炎作用邓音乐等[47]的研究表明太子参环肽B对白色念珠菌的黏附性和致病性具有很好的抑制作用,在抗白色念珠菌感染药物开发方面具有很好的应用前景。谢海峰等[48]的研究表明太子参环肽B可显著改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎;环肽B通过激活AMPK显著改善肠上皮内稳态,并重塑肠道微生物群,尤其是提高了黏液阿克曼菌的相对丰度[49],从而起到预防溃疡性结肠炎的作用,可用于制备治疗溃疡性结肠炎疾病的药物。Yang等[50]的研究表明环肽B通过P13K/Akt信号通路抑制细菌脂多糖(LPS)诱导的炎症和凋亡,是治疗炎症性疾病的潜在治疗靶点。

2.2.3 抗癌作用Tantai等[51]的研究表明环肽B通过介导P13K/Akt/β连环蛋白途径并调节黏附和侵袭相关基因的表达水平,有效抑制人食管癌细胞的黏附和侵袭。Chen等[52]的研究表明环肽B抑制食管癌的机制有两点:①抑制MMP9、MMP2、CCND1、STAT3、CXCR4、BDKRB1、PTGS2等75食管癌靶点;②正调控蛋白质水解、胶原蛋白分解代谢过程、细胞外基质分解、细胞增殖的正调控、胞浆钙离子浓度等生物过程。

2.2.4 其他作用太子参环肽B还具有降血糖、减少皮肤中的黑色素、促进血管新生等作用。Morita等[53]的研究表明从太子参中提取和鉴定到的太子参环肽 B,可以通过抑制酪氨酸酶的合成减少皮肤中的黑色素。林少兵[54]的研究表明太子参环肽B有明显促进血管新生作用。Liao等[55-56]的研究表明环肽B可通过抑制二肽基肽酶4(DPP-4),减缓GLP-1降解;同时可作为激动剂刺激GLP-1R促进胰岛素分泌,从而起到降血糖的作用。谢海峰等[57-58]的研究表明环肽B可通过抑制TGF-Smad2/3信号和AMPK介导的STING信号,显著改善博来霉素诱导的小鼠肺纤维化,可用于制备治疗肺纤维化疾病的药物。

2.3 太子参多糖与环肽B含量的影响因素太子参多糖及环肽B含量不同产区差异较大,这与其生长环境、生长发育状态及人为等因素密切相关。

在生长环境方面,康传志等[59]的研究表明太子参多糖及环肽B与土壤中有效钾、铵态氮、速效磷及Cu、B、Zn、Pb、Cr元素无显著相关性。彭益书等[60]的研究表明太子参环肽B含量与种植土壤Ca、Cd、Mg含量及pH呈正相关,与种植土壤Rb、Mn呈负相关。马阳等[61]的研究表明气候因子中月最低气温、月平均空气湿度、月降水量以及年降水量是影响太子参指标成分含量的主导因素,其中月最低气温与环肽B呈正相关;年降水量与多糖含量呈正相关,却与环肽B呈负相关。康传志等[62]的研究表明太子参多糖并不是气候主导型的代谢物质;而环肽B含量与降水量相关,其含量总体呈现从东南向西北先升高后减低的趋势,与全国降水量变化情况相一致。

在生长发育方面,太子参多糖及环肽B含量与采收时间、采收部位、种植材料等相关。吴玉香等[63]的研究表明常规的太子参多糖积累最佳时期是6、7月,此段时间内随着采收期的推迟多糖含量会下降。邹立思等[64]的研究表明太子参块根环肽B含量7月为最高峰,含量为311.895 μg·g-1。陈传艺等[65]的研究表明贵阳太子参种子种植的多糖含量为42.61%,低于块根种植的多糖含量(47.53%);而环肽B含量却高于块根种植的,种子种植的环肽B含量为0.0240%,块根种植的环肽B含量为0.0217%。陈前锋等[66]表示太子参须根亦具有经济价值,其从中分离到4个环肽类化合物,分别为pseudostellarin L、heterophyllin B、pseudostellarin B、pseudostellarin C。朱宏涛等[67]的研究表明太子参组培苗环肽B含量为492.33 μg·g-1组培苗干重。

在人为因素方面,包含栽培模式及加工贮藏方法。在栽培模式方面,吴红淼等[68]的研究表明连作会干扰太子参的代谢过程,而菌肥修复可有效改善重茬太子参品质;菌肥改良组多糖含量与正茬组无显著性差异,约为30 mg·g-1;环肽B含量(约15 μg·g-1)显著低于正茬组(约24 μg·g-1),但显著高于重茬组(约8 μg·g-1)。曾丽娜[69]的研究表明阴坡上种植的太子参各有效药用成分的含量均高于阳坡,具体为阳坡多糖含量是阴坡的82.5%,环肽B含量是阴坡的95.9%,总皂苷含量是阴坡的56.2%;玉-参、稻-参、豆-参3种轮作模式下环肽B含量均低于正茬,但高于重茬,分别为重茬含量的1.18倍、1.16倍和1.12倍;稻-参轮作多糖含量仅次于正茬,约为正茬的85.65%,是重茬含量的1.52倍。在加工贮藏方面,众多学者的研究皆表明阴干有利于太子参多糖和环肽B的保留:徐荣等[70]采用阴干、晒干、微波真空干燥、远红外干燥等13种方式对太子参新鲜块根进行干燥,结果表明太子参粗多糖含量在16.29%～26.73%之间,其中阴干处理太子参多糖含量为26.73%,显著高于其他干燥方式;环肽B含量为0.020 7%,亦为最高;罗文敏等[71]采用传统加工、现代恒温烘干及变温烘干等12种方法加工太子参,结果表明传统加工方法环肽B含量在0.017%～0.025%之间,现代烘干方法环肽B含量在0.015%～0.027%之间,其中阴干处理环肽B含量为0.0251%,位于第三,次于70～110 ℃(环肽B含量为0.0268%)及70～90 ℃(环肽B含量为0.0254%)处理。强静等的研究表明随着贮藏时间延长,多糖含量降低,其选取不同贮藏时间的样品2005-09-27、2006-04-25、2006-10-25、2007-04-25,经检测多糖含量分别为17.42%、17.13%、16.76%、16.27%[72]。

3 指纹图谱研究

3.1 基于液相色谱的指纹图谱高效液相色谱法具有操作简便、灵敏度高、效率高及速度快等特点,在中药指纹图谱中被广泛应用。太子参高效液相色谱检测波长通常为203 nm;流动性为乙腈-水梯度洗脱;色谱柱为C18;柱温则根据检测环境温度选择25、30 ℃;流速为0.8、1.0 mL·min-1;进样量10、20 μL。随着质谱技术的发展,学者们通常将高效液相色谱与质谱联用,以达到对复杂体系定性和定量分析的目的。近年来学者们针对太子参块根、饮片、颗粒等材料,采用高效液相色谱及相关技术建立了相应的指纹图谱,具体见表2。

表2 基于液相色谱的太子参指纹图谱

3.2 基于毛细管电泳的指纹图谱高效毛细管电泳(HPCE)是一种基于不同质荷比的离子在同一电场下迁移速度不同的分离手段,具有分离效率高、析速度快等特点[78]。李文龙等[78-79]应用该技术建立了江苏、福建、安徽、贵州、湖南、浙江、山东的太子参指纹图谱。

3.3 基于气相色谱及红外光谱的指纹图谱刘训红等[80]采用气相色谱-质谱联用技术对江苏、福建、贵州、安徽的太子参挥发性成分进行了分析,结果表明含有12个共有峰,占挥发性总成分的80%左右。这12个物质分别为吡咯、己醛、糠醛、糠醇、2-戊基呋喃、3-呋喃甲基乙酸酯、4-丁基-3-甲氧基-2,4-环己二烯-1-酮、4-丁基-3-甲氧基-2-环己烯1-酮、未鉴定A、2-环己烯-1-醇-苯甲酸酯、未鉴定B、正-十六烷酸。万忠民等[81]采用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)建立了太子参 FTIR 指纹图谱,该图谱能区分栽培品和野生品的差异。

4 结语

随着分析技术的进步太子参化学成分被逐渐挖掘出来,药理作用也越来越清晰,越来越被人们看好,并大力推广种植。但存在以下问题:①在化学成分研究上,关于它们的合成和基因表达机制尚不明确[15];②在种植上,太子参自人工种植以来,极大地减少了太子参野生资源的压力,缓解了太子参野生资源紧缺的问题,满足了市场的需求。但人工种植过程中以太子参块根进行无性繁殖,病毒可经无性繁殖材料一代一代在块根中积累,病毒病已成为危害太子参生产的重要病害。目前关于太子参病毒病的防治有两种方法:第一种方法是化学防治,郑明强等[82]的研究表明抗病毒1号复配剂在防控已经发生的病毒病及提升产质量具有显著效果。姚永松[83]的研究表明病毒病初期可用平平佳粉剂600倍液+营养增效剂100倍液进行防治;第二种方法是控制种苗传毒,即使用脱毒苗,虽然目前已建立成熟的太子参脱毒繁育体系,但在生产上没有形成完整的产业体系;③在指纹图谱研究上,虽然相关研究较多,亦未形成一个标准。未来在这些问题上需要更深层次的研究,以逐步形成标准化、规范化的种植技术方案,明确太子参活性物质的分子调控模式,完善太子参内在质量评测指标,为太子参在食品、保健食品和药品等方面的开发与利用提供参考。