基于网络药理学探索百部异病同治肺癌与咳嗽的共同作用机制

张 松 赵 宁

（1.中国政法大学校医院，北京，100088；2.中国中医科学院西苑医院药学部，北京，100091)

百部是有着悠久历史的传统中药，其味甘、苦、性微温，具有润肺下气止咳，杀虫灭虱等功用[1]。百部主要化学成分和有效成分为生物碱[2]，用于治疗咳嗽、肺痿、肺炎、感冒、牛皮癣、肺癌、阴虱、阴道炎、螨虫病、疥疮等[3-4]。

咳嗽是肺癌最常见症状之一，也多为首发症状[5]。咳嗽是身体的一种防御性神经反射，能够促进呼吸道内分泌物的排出和异物的清除，但高频率且剧烈的咳嗽会对患者的生活产生严重的负面影响。在西医理论及临床实践中，肺癌与咳嗽的治疗药物往往不同，很少用同一个药物同时治疗肺癌和咳嗽。百部在临床应用中涉及肺癌和咳嗽，是中医理论异病同治的有效体现，但其同时治疗肺癌和咳嗽的作用机制未见报道。因此，本研究通过网络药理学的方法，从分子作用机制角度探索百部与肺癌和咳嗽之间的关系，为百部异病同治肺癌与咳嗽的研究开展提供一定的理论依据，现报告如下[6]。

1 资料与方法

1.1 筛选百部的活性成分

使用中药系统药理学分析平台（http://lsp.nwu.edu.cn/），以“百部”为关键词键入Herb name，检索全部化学成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，且类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件进行活性成分筛选，得到百部中具有较高活性且可能入血的活性成分（检索时间：2023年3月6日）。

1.2 预测分析百部化学成分的靶点

通过中药系统药理学分析平台“Related Targets”收集筛选得到的活性成分对应的靶点蛋白，并在Uniprot（http://www.uniprot.org/）使用Uniprot KB 检索功能，以“organism：homo sapiens”和“reviewed：yes”为检索条件，获取活性成分对应人类的相关潜在靶点基因。

1.3 确定疾病靶点

通过Genecards数据库（https://www.genecards.org/）检索肺癌（lung cancer）与咳嗽（cough）的疾病相关基因（检索时间：2023年5月7日）。

1.4 预测百部对肺癌和咳嗽作用靶点

建立百部活性成分靶蛋白及肺癌和咳嗽Excel文件，利用Excel筛选功能，映射出百部活性成分靶蛋白与肺癌和咳嗽靶蛋白交集的关键靶点。将其导入STRING数据库（https://string-db.org/），从数据库中获取筛选出的交集蛋白靶点之间的关系信息。将结果导入Cytoscape 3.8.2软件，以自由度（degree）进行可视化及网络拓扑学分析，并将交集靶点绘制成网络图，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI）。

1.5 百部肺癌和咳嗽作用靶点的功能注释分析

利用Metascape数据库（https://metascape.org），选择人类作为研究对象，将百部的有效作用靶点上传，进行基因本体功能（Gene Ontology，GO）通路富集分析和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的通路富集分析，并进行可视化处理，得到百部在肺癌和咳嗽中的主要作用通路。

2 结果

2.1 有效活性成分的筛选

检索TCMSP数据库，得到百部中有效活性成分110个。按“OB≥30%、DL≥0.18”筛选，得到32个有效活性成分，见表1。

表1 百部有效活性成分

2.2 百部化学成分靶点的预测

检索中药系统药理学分析平台，得到百部每个活性成分作用的靶点，使用UniProt数据库进行矫正，得到对应靶点的基因名，共得到百部的靶点基因102个。

2.3 百部对肺癌与咳嗽作用靶点的预测及相互作用分析

在Genecards数据库中检索Keywords：lung cancer，共得到相关基因23 107个，按score评分取中位数得关键基因共1 449个；检索Keywords：cough，共得到相关基因4 396个，按score评分取中位数得关键基因共1 850个，再将百部的活性成分对应的102个靶点基因与肺癌和咳嗽对应的关键基因进行交集，共得到37个交集靶点，见图1。

图1 药物-疾病靶点合集venny图

2.3.1 疾病-靶点-有效成分网络的构建

将疾病与药物有共同靶点的活性成分和共同靶点导入Cytoscape 3.8.2软件，见图2，构建了疾病-靶点-活性成分的网络图，其中包括活性成分27个，按照degree排序依次主要包括刺芒柄花素、β-谷甾醇、7-甲氧基-3-甲基-2,5-二羟基-9,10-二氢菲、芝麻素、二去氢新对叶百部碱、二去氢百部新碱B、蔓生百部酰胺、直立百部类生物碱B等。

图2 疾病-关键靶点-活性成分网络关联图

2.3.2 构建PPI网络图

将筛选出的37个交集靶点导入STRING数据库，置信度设为＞0.400，剔除游离的靶点蛋白，进行蛋白质相互作用的PPI网络图构建，见图3，得到百部对肺癌与咳嗽异病同治的蛋白靶点作用网络图。同时将结果通过Cytoscape 3.8.2软件进行网络分析，节点Degree中位数为17，获得关键靶点14个，按靶点与成分相关性考察，依次为PTGS2、AR、NOS2、NR3C1、ESR1、PGR、JUN、MAPK14、CASP3、CASP8、CASP9、CCND1、IL10、IL4、NOS3、PPARG、TGFB1（见图3），这些靶点可能是百部对肺癌和咳嗽异病同治中潜在关键点。

图3 交集靶点PPI关联图

2.4 基因功能分析

2.4.1 GO富集分析

利用Metascape数据库设置物种参数H species，P值小于0.01，对百部和肺癌与咳嗽共同有效作用靶点进行GO功能富集分析，得到767条富集结果，见图4，其中生物学过程（Biological Processes，BP）条目683个，主要包括细胞对有机环状化合物的反应、对雌二醇的反应、对药物的反应、血液循环、髓细胞分化、血管形态发生等。细胞组成（Cellular Components，CC）条目27个，主要包括膜筏、细胞器外膜、受体复合物、转移酶复合物、转移含磷基团。分子功能（Molecular Functions，MF）条目57个，包括核受体活性、蛋白质结构域特异性结合、转录因子结合、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡信号通路等。

图4 GO BP、CC、MF富集图

2.4.2 KEGG富集分析

利用数据库Metascape对百部、肺癌与咳嗽疾病共同有效作用靶点进行通路富集分析，共165条（见图5），经筛选（P＜0.05）主要涉及癌症的途径、利什曼原虫感染、内分泌抵抗、病毒致癌、小细胞肺癌、癌症中的蛋白多糖、血清促能突触、血管内皮生长因子信号通路、催产素信号通路、肿瘤中的MicroRNAs等。

图5 KEGG Pathway气泡图

3 讨论

网络药理学[7]是以系统生物学为基础，结合计算机技术，通过构建“疾病-靶点-有效成分”网络，系统地揭示药物多组分与疾病多靶点的关系及其作用机制，与中医学整体论、辨证论治的指导原则相符[8]，并用于阐释中医“异病同治”理论和实践[6]。传统中药百部在肺癌及咳嗽的治疗中被广泛应用，且肺癌患者多伴有咳嗽，因此，本研究利用网络药理学手段，探讨百部“异病同治”的可能治疗靶点及作用机制。

百部的化学成分研究已分离出150多种百部生物碱[9]，药理学研究包括驱虫、镇咳、抗肿瘤、抗结核、抗慢性阻塞性肺疾病等[10]。在治疗咳嗽方面，有学者发现百部可降低组胺动物模型呼吸中枢的兴奋性，使支气管平滑肌痉挛松弛；降低咳嗽因子TRPA1基因及蛋白水平的表达[11]。在抗肿瘤方面，对叶百部总生物碱可能通过抑制PI3K/Akt信号通路和激活JNK/p38 MAPK信号通路，诱导人肺癌A549细胞凋亡[12]，对肝癌[13]、甲状腺瘤[14]、结直肠癌[15]等均有显著的抑制作用。

本研究发现，百部治疗肺癌和咳嗽相关的主要基因有PTGS2、AR、NOS2、NR3C1、ESR1、PGR、JUN、MAPK14、NOS3等。其中前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）基因已证实可以促进肿瘤、癌症的形成[16]，肿瘤血管生成、表型改变、细胞黏附增加和抗凋亡也与PTSG2其上调有关，特别是PTGS2多态性与肺癌有潜在的协同关联[17]。同时，百部对PTGS2靶点的影响在基因和蛋白质水平均得到有效验证[18]。雄激素受体（AR）是一种调节基因表达的DNA结合转录因子[19]，有学者发现AR信号通路基因中单核苷酸表现出的多态性，与非小细胞肺癌（EGFR敏感突变的）发生脑转移的风险密切相关[20]。作为启动子参与细胞增殖和靶组织分化增生的NR3C1可能负性调控内毒素诱导的小鼠急性肺损伤中MAPK4的表达[21-22]。c-JUN是调控细胞程序JUN家族成员之一[23]，肺癌发生发展可能与其过度表达有关，在提示NSCLC的诊断、转移及预后方面均有一定的临床应用意义。NOS3基因与肺癌患者发生≥2级放射性肺损伤的风险显著相关[24]。NOS2和JUN[25]、MAPK14在肉瘤大鼠中参与蛋白信号转导，在抑制肿瘤的生成、增殖、迁移以及血管生成中发挥重要作用[26]，其中MAPK14在百部治疗咳嗽靶点得到有效进行验证[18]。

GO和KEGG富集结果中癌症途径、小细胞肺癌途径、病毒致癌途径、肿瘤中的MicroRNAs途径、VEGF信号通路和肺癌直接相关。转录因子NF-κB与许多基因的转录启动相关，参与免疫和炎症反应及肿瘤的发生与转移，NF-κB诱导多种炎性细胞，参与多个气道慢性炎症反应环节[27]，同时多种原癌基因和化学物质也可以激活NF-κB，通过正反馈或负反馈环路调控MicroRNAs的表达和功能，形成网络型基因调控，在肿瘤相关性炎症信号中处于核心地位，将炎症与肿瘤在分子层面紧密连结[28]。血管内皮生长因子（VEGF），参与肿瘤心血管生成[29]和呼吸系统疾病中的气道重塑[30]，是治疗肿瘤和呼吸系统疾病的主要靶点之一。

综上所述，本研究利用网络药理学推测，百部中的多种化学成分，通过PTGS2、NOS2、NR3C1、ESR1、JUN等多靶点，转录因子、肿瘤中的MicroRNAs、VEGF信号通路、癌症途径、癌症中蛋白多糖通路等途径参与肺癌和咳嗽的双向调节机制，为百部异病同治肺癌和咳嗽的药理学研究提供新的思路和一定方向。但本研究仅利用中药网络药理学技术，虽然部分靶点或通路已在百部治疗肺癌或者咳嗽中得到验证，但具体的调控机制及关键靶点，需进一步通过分子模拟对接、谱效关系、基础实验研究等方法进行探索和验证。