多指标正交试验优化损伤中期口服液的提取工艺*

何清华，徐 伟,2，杨云芝,2，范润勇,2，周 茜

（1.南充市中医医院，四川 南充 637000；2.筋骨病中医药防治南充市重点实验室，四川 南充 637000）

损伤中期合剂[1]是南充市中医医院骨伤科常用中药制剂。该方来源于院内临床老专家的协定方“损伤合剂系列”之一，由陈皮、麸炒枳壳、骨碎补、黄芪等中药组成，具有益气活血、续筋接骨的功效，用于治疗骨伤疾病中期阶段。损伤中期合剂20世纪90年代初就已应用于临床骨伤科，并于2007年经四川省食品药品监督管理局批准注册为损伤中期合剂。后历经几次再注册，损伤中期合剂于2022年转为备案品种，备案号为：川药制备字20220363000。损伤中期合剂临床使用至今已达三十余年，疗效确切。南充市中医医院骨伤科为四川省中医重点专科，骨伤疾病患者人数众多，年门诊人次达15万余人次。该方临床骨伤患者使用率占比95%以上。由于该制剂为传统合剂，药液有效成分纯度不高，且为多剂量玻璃瓶大包装，易碎。患者服用时需撬开铝盖分剂量服用，且服用量大。损伤中期合剂开盖后还需冷藏保存，导致患者携带、服用、保存不方便。由于该制剂临床应用较早，早期研究仅对提取质量进行了简单的定性研究，而未进行药物成分含量的定量研究，导致制备工艺简单，不易判断药物提取质量的优劣。因此，本研究以提取溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷4种成分含量[2-5]及收膏率为评价指标进行综合评分，采用正交试验设计对损伤中期口服液的提取工艺进行优化，同时通过对处方中的多种成分含量的测定分析，筛选最佳提取工艺参数，以全面客观地评价提取工艺的优劣，以期为该制剂生产的高效提取提供依据。

1 仪器与材料

1.1 主要仪器 LCK2000型煎药机（天津三延精密机械有限公司）；ES1035B型十万分之一分析天平（上海力辰邦西仪器科技有限公司）；Ultimate 3000型高效液相色谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；G-100S型超声波清洗器（深圳市哥能清洗设备有限公司）；SYG-4型数显恒温水浴锅（常州朗越仪器厂）；WGL-45B型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；TD5A医用离心机（常州市金坛高科仪器厂）。

1.2 试剂与药物 黄芪饮片（批号：220709-11）、陈皮饮片（批号：220518-21）、麸炒枳壳饮片（批号：221214-31）、骨碎补饮片（批号：220415-11）、当归饮片（批号：220528-21）、羌活饮片（批号：230108-11）、白芍饮片（批号：220921-11）、酒川芎饮片（批号：220912-11）均购自成都吉安康药业有限公司，经南充市中医医院药学部主任中药师杨云芝鉴定，均符合2020年版《中华人民共和国药典》[6]的要求；对照品毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201907，纯度：96.8%）、橙皮苷（批号：110721-202220，纯度：97.2%）、新橙皮苷（批号：111857-201804，纯度：99.4%）、柚皮苷（批号：110722-202116，纯度：93.5%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱醇，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 提取方法 根据处方药物比例称取原料，加水煎煮提取、过滤，浓缩，离心，加纯化水定容至1 000 mL的样品溶液，备用。

2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量测定

2.2.1 色谱条件 以Agilent Zorbax SB-18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱；以乙腈-0.2%磷酸溶液（18：82）为流动相等度洗脱；流速为1.0 mL/min，进样量为5 μL，柱温为25 ℃，检测波长为283 nm。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷对照品适量，分别加甲醇溶解制成质量浓度分别为217.03、765.94、1 006.92、2 750.80 μg/mL的溶液。精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷溶液1 mL、柚皮苷溶液2 mL、橙皮苷溶液2 mL、新橙皮苷溶液4 mL至10 mL容量瓶中，定容至刻度，配制成毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷质量浓度分别为21.70、153.19、402.77、550.16μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取“2.1”项下制备的样品溶液1 mL置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 根据处方药物比例分别称取缺黄芪、缺陈皮、缺麸炒枳壳、缺骨碎补的原料，按照“2.1”提取方法制备阴性溶液，再按照“2.2.3”项下方法制备缺黄芪、缺陈皮、缺麸炒枳壳、缺骨碎补的阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 精密吸取供试品溶液，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷混合对照品溶液，阴性对照溶液各5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，供试品溶液与混合对照品溶液色谱中相同的保留时间处有对应峰，阴性对照溶液无对应峰，表明该方法专属性强。色谱图见图1。

图1 混合对照品、供试品、阴性对照高效液相色谱图

2.3.2 线性关系考察 取“2.2.2”项下的混合对照品溶液配置成分别含毛蕊异黄酮葡萄糖苷1.36、2.71、5.43、10.85、21.70 μg/mL，橙皮苷4.79、9.57、19.15、38.30、76.60、153.19 μg/mL，新橙皮苷12.59、25.17、50.35、100.69、201.39、402.77 μg/mL，以及柚皮苷17.19、34.39、68.77、137.54、275.08、550.16 μg/mL的梯浓度，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定分析，以质量浓度为横坐标（X），以峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程分别为Y=0.157 8X-0.000 5（r=1.000 0），Y=0.146 2X-0.012 5（r=1.000 0），Y=0.160 9X-0.007 8（r=1.000 0），Y=0.155 7X+0.011 8（r=1.000 0），线性范围分别为1.36～21.70 μg/mL，4.79～153.19 μg/mL，12.59～402.77 μg/mL，17.19～550.16 μg/mL，表明各成分质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 取“2.2.2”项下混合对照品溶液适量，按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次进行测定。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷峰面积的RSD值分别为0.21%，0.11%，0.13%，0.11%，表明该仪器的精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷峰面积的RSD值分别为0.95%，0.28%，0.25%，1.79%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 精密吸取同一样品溶液，分别按照“2.2.3”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷平均质量浓度分别为3.98，30.45，69.92，94.79 μg/mL，RSD值分别为0.45%，1.12%，0.20%，0.43%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密吸取同一供试品溶液，分别加入一定量的混合对照品溶液，平行制备供试品溶液6份，按照“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷平均加样回收率分别为97.46%，98.56%，96.90%，97.30%，RSD值分别为1.22%，1.13%，0.83%，1.41%。

2.4 评价指标 以有效成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率的综合评分为评价指标。

2.4.1 多指标综合评分[7-9]根据中药君、臣、佐、使的配伍原则，以及各指标在处方中的相对重要性不同，对上述各指标进行权重系数分配[10-11]，分别为毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量0.40、橙皮苷含量0.15、新橙皮苷含量0.15、柚皮苷含量0.20、收膏率0.10。综合得分=毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量/毛蕊异黄酮葡萄糖苷最大含量×0.40×100+橙皮苷含量/橙皮苷最大含量×0.15×100+新橙皮苷含量/新橙皮苷最大含量×0.15×100+柚皮苷含量/柚皮苷最大含量×0.20×100+收膏率/最大收膏率×0.10×100。

2.4.2 提取液收膏率的测定与计算 精密量取“2.1”项下制备的样品溶液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿（ma）中，水浴蒸干后于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，立即称定质量（mb），收膏率=（m为处方药材质量，V为样品溶液体积）[12-13]。

2.5 正交试验优选损伤中期口服液的最佳提取工艺

2.5.1 因素水平选择 前期研究考察了影响提取效率的多种因素：浸泡时间、加水量、提取时间、提取次数、浓缩温度。浸泡时间与浓缩温度对提取效率的影响不明显，不作为此次考察的重点。本研究主要考察了加水量、提取时间和提取次数3个因素。结果表明，随着加水量的增加，综合得分升高。当加水量增加到9倍以上时，综合得分相差不明显。因此本研究选择了综合得分较高的5倍、7倍、9倍加水量，得分分别为55.58分、72.07分、97.05分。提取时间考查了40 min至2.5 h时间段。本研究随着提取时间的延长，综合得分升高。当时间超过2 h后，随着时间延长，综合得分反而降低，说明在提取2 h后，随加热时间的延长，有效成分含量减少。因此本研究确定了1～2 h作为考查时间段，重点考察了综合得分较高的提取时间1、1.5、2 h，得分分别为95.54分、99.52分、96.06分。本研究考查了1～5次的提取次数，随着次数增加，综合得分升高。当提取第4次及以上时，综合得分变化不明显，说明药物溶出已趋于稳定。4次以后的提取物占比较少，因此本研究选择了综合得分较高的提取次数1次、2次、3次作为重点考查，得分分别为79.86分、94.02分、99.17分。另外同时也考滤生产效率和成本，本研究最终确定了加水量为5倍、7倍、9倍3个水平，提取时间为1、1.5、2 h 3个水平，提取次数为1次、2次、3次3个水平，为正交试验因素水平的选择提供依据。

2.5.2 正交试验[14-16]按处方药物比例分别称取药物9份，在前期单因素试验的基础上，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷含量及收膏率的综合评分为评价指标进行L9（34）正交试验设计，优选损伤中期口服液的最佳提取工艺。因素水平见表1，试验设计及结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计与结果

A因素影响综合得分，差异有统计学意义（P＜0.05），影响程度依次为A＞C＞B，优选出最佳的工艺为A3B1C3，即加水量9倍，提取1 h，提取3次。

2.6 提取工艺验证试验 为验证优选提取工艺的稳定性与合理性，需进行验证。根据处方药物比例称取药物3份，按照正交试验优选出的提取工艺制备供试品溶液3份，分别测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率。（见表4）

表4 提取工艺验证试验结果

3批验证试验结果数据间无明显差异，表明优选出的提取工艺稳定可靠，重复性良好。

3 讨论

根据骨折不同阶段的症状特点，临床常采用三期疗法进行治疗[17-18]。中期阶段瘀血未尽，治疗以益气活血、祛瘀生新、接骨续筋为主，常使用黄芪、陈皮、骨碎补、续断等中药。损伤中期口服液处方由黄芪、当归、陈皮、茯苓、麸炒枳壳、骨碎补、续断等药物制成，具有益气活血、续筋接骨的功效。本试验选取处方中具有重要治疗作用的君药与臣药的活性成分为研究对象，代表处方药物的综合提取成分，对提取工艺进行考察。方中黄芪具有补气健脾、益卫固表之功，为君药；陈皮可理气健脾，燥湿化痰；麸炒枳壳具有理气宽中、行滞消胀的功效；骨碎补具有补肾强骨、活血止痛的功效，与陈皮、麸炒枳壳共为臣药。黄芪的活性成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、陈皮的活性成分橙皮苷、麸炒枳壳的活性成分新橙皮苷、麸炒枳壳与骨碎补的共同活性成分柚皮苷4种成分均为苷类化合物，都易溶于水，因此本研究采用加水煎煮提取[19-22]。中药复方成分复杂，治疗疾病时往往不是单一成分起治疗作用，而是多成分多靶点协同作用。药物的综合提取成分为其治疗作用的物质基础。目前，多指标综合评分法已广泛应用于复方药物制剂工艺的筛选。该方法通过对多个指标分配权重系数，计算综合评分。因此，为了能更好地评价中药处方药物提取的综合疗效，本次试验对多种活性成分的含量进行测定，以总提取物收膏率的综合评分为评价指标，采用正交试验设计，来优选损伤中期合剂的最佳提取工艺，并进行了验证。与早期一般的定性研究比较，该方法能更全面、更准确地评价提取工艺的优劣。根据中药君、臣、佐、使的配伍原则，以及各指标在处方中的相对重要性不同，本研究针对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷4种成分和收膏率指标，划分了权重系数，分别定为0.40、0.15、0.15、0.20、0.10。根据正交试验及方差分析结果，优选出的最佳提取工艺为：加水量9倍，提取1 h，提取3次。毛蕊异黄酮葡萄糖苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量及收膏率数据无明显差异，说明筛选出的提取工艺重复性好，质量稳定，提取率高，为损伤中期口服液生产的高效提取提供了理论依据。但本次试验只对提取工艺进行了考察，未考察不同浓缩方法、浓缩时间对成分含量的影响，后续试验应将上述因素纳入考察。