响应面试验优化福林酚法测定三叶木通果皮多酚含量及其抗氧化活性

李艳辉，杨蕊西，何靖怡，袁亚宏，岳田利，盛庆林

（西北大学食品科学与工程学院，陕西西安 710069）

三叶木通（Akebia trifolia），俗称“八月瓜”“八月炸”“野香蕉”等，广泛分布在我国19 个省的山脉中，包括甘肃、陕西、山西、河北、四川等。三叶木通凭借其优良的药用价值，在中药成分中占有一席之地，被称为“预知子”，用来治疗水肿、舌痛、闭经等疾病[1]。三叶木通最大的特点是当果实成熟时，果皮会沿着腹部缝合线纵向裂开，常发生在农历8 月，因此三叶木通有了“八月瓜”这个美名。

近年来，由于生活水平不断提高及市场消费结构的改变，三叶木通作为一种保健水果越来越受到大众的喜爱，主要是因为三叶木通富含丰富的营养物质，并且风味甘甜、柔软多汁。三叶木通果皮中富含各种植物化学成分，这些化学物质已被证明具有抗炎[2]、抗菌[3]和体外抗氧化作用[4]。张孟琴等人[5]采用多种方法测定了三叶木通果皮的基本理化指标。有研究表明，果皮中果胶、蛋白质、还原糖、总糖等营养物质和黄酮类、多酚类、皂苷等活性物质丰富。在材料研究方面，果皮提取物被用于开发活性包装膜、制备纳米颗粒，甚至作为环境保护的缓蚀剂。除此之外，三叶木通果实的应用与专利研究也有很多。例如，发酵型八月瓜复合饮料、八月瓜酸奶、复合酵素、富硒八月瓜饮料等。果皮经常被当作垃圾丢弃，不但造成了资源的浪费，而且在很大程度上污染了环境。以三叶木通果皮为研究对象，对比了80%甲醇、60%乙醇、水3 种溶剂得到的提取物的抗氧化活性能力，同时采用响应面优化福林酚法测定了提取物的多酚含量，为三叶木通果皮的开发利用提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三叶木通（即八月瓜），购自四川凉山，挑选表面光滑、无虫害、机械损伤较轻的成熟八月瓜置于阴凉处保存备用。

没食子酸标准品、福林酚试剂、TPTZ 溶液、Trolox 标准品、1,1 -二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH）、Na2EDTA、啡咯嗪（Ferrozine）、pBR322质粒DNA，美国Sigma 公司提供；琼脂糖、甲醇、乙醇、碳酸钠、盐酸、FeCl3、FeSO4，上海源叶生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

多功能粉碎机、电子分析天平、LC-10N/12N/18N冷冻干燥机、超声波清洗仪、抽滤机、LC-RE-52AA旋转蒸发仪、凝胶电泳仪、紫外分光光度计、水浴锅、凝胶呈像仪等。

1.3 试验方法

1.3.1 三叶木通果皮提取的工艺流程

三叶木通果皮提取的工艺流程图见图1。

图1 三叶木通果皮提取的工艺流程图

1.3.2 三叶木通果皮粗提粉的体外抗氧化活性测定

（1）清除DPPH 自由基能力的测定。清除DPPH自由基能力的测定参考R Scherer 等人[6]的方法并加以修改，于波长517 nm 处测定吸光度。

（2）FRAP 能力的测定。FRAP 能力的测定参考I F F Benzie 等人[7]的方法并加以修改。以Trolox 为标准品，于波长593 nm 处测定吸光度。

（3）对Fe2+络合能力的测定。对Fe2+络合能力的测定参考N Singh 等人[8]的方法并加以修改。于波长562 nm 处，以EDTA-2Na 为对照品进行吸光度测定。

（4）对·OH 诱导的pBR322 质粒DNA 氧化损伤的保护。对·OH 诱导的pBR322 质粒DNA 氧化损伤的保护采用琼脂糖凝胶电泳法，参考B Tepe 等人[9]的方法并加以修改。结果用凝胶呈像仪拍照，用Quantity One 软件对每个条带进行光密度分析。

琼脂糖凝胶电泳法各组加样量见表1。

表1 琼脂糖凝胶电泳法各组加样量/μL

1.3.3 三叶木通果皮粗提粉中多酚含量的测定

多酚含量的测定采用Folin-ciocalteu 分光光度测定法，参照J Rumpf 等人[10]的方法并加以修改。对照品选用质量浓度为0.2 mg/mL 的没食子酸溶液，样品溶液为1 mg/mL 的果皮粗提粉溶液。

1.3.4 三叶木通果皮粗提粉多酚测定条件的优化

对Folin-Ciocalteu 分光光度法中福林酚试剂稀释倍数（0，2 倍，4 倍，6 倍，8 倍）、20%碳酸钠用量（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL）、反应温度（20，30，40，50，60 ℃）和反应时间（50，70，90，110，130 min）[11]这4 个因素设计单因素试验，测定三叶木通果皮粗提粉中多酚的含量。

以单因素试验结果为依据，将多酚含量作为响应值，将福林酚试剂稀释倍数、20%碳酸钠用量、反应温度和反应时间作为四因素，根据响应面设计原理对三叶木通果皮粗提粉中的多酚含量设计四因素三水平试验。

响应面设计的因素与水平设计见表2。

表2 响应面设计的因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 三叶木通果皮粗提粉的体外抗氧化活性测定结果

2.1.1 清除DPPH 自由基能力的测定

标准曲线图见图2。

图2 标准曲线图

DPPH（2,2 -二苯基-1 -三硝基肼基）相对较安全且便宜，根据体内自由基稳定的机制起作用[12]。3 种方法获得提取物的清除DPPH 自由基能力的标准曲线（见图2（a）～（c）），经计算得，80%甲醇、60%乙醇、水提取物对DPPH 自由基的清除能力分别为（28.33±0.12），（13.21±0.04），（6.02±0.05）mg/mL。

2.1.2 FRAP 能力的测定

FRAP（Ferric ion reducing antioxidant power）用来测定总抗氧化能力，简单且直接。Trolox 标准曲线（见图2（d）），拟合回归方程为Y=0.054 1X-0.001 3（R2=0.999），计算得80%甲醇、60%乙醇、水提取物的FRAP 能力分别为（20.51±0.02），（10.15±0.11），（4.25±0.04）mg/g。

2.1.3 对Fe2+络合能力的测定

络合能力测定抗氧化能力的原理是Fe2+可以催化Fenton 反应的进行，对机体产生氧化应激[13]。EDTA-2Na 标准曲线（见图2（e）），拟合回归方程为Y=-0.012 9X+0.975 6（R2=0.991），计算得80%甲醇、60%乙醇、水提取的APPE 对Fe2+的络合能力分别为（23.11±0.14），（11.34±0.21），（4.20±0.01）mgEDTA-2Na/g。

2.1.4 对·OH 诱导的pBR322 质粒DNA 氧化损伤的保护

Fe2+和H2O2混合会发生Fenton 反应（Fe2++H2O2→Fe3++·OH+-OH），从而产生羟基自由基，破坏DNA的超螺旋结构[14]。通过琼脂糖凝胶电泳，会出现2 个条带，移动快的是超螺旋DNA，移动较慢的是开链和线性形状DNA[15]。

不同提取方式对DNA 的保护作用见图3，不同提取方式对DNA 的保护作用见表3。

表3 不同提取方式对DNA 的保护作用/%

图3 不同提取方式对DNA 的保护作用

由图3 和表3 可知，3 种提取方法得到的提取物对·OH 诱导的pBR322 质粒DNA 的氧化损伤均有保护作用。其中，80%甲醇组的开链占比最低，为41.53%；其次是60%乙醇组，为43.34%；水组的开链占比最高，为46.81%。

2.2 单因素试验结果分析

20%碳酸钠用量、反应温度、反应时间及福林酚稀释倍数对多酚测定结果的影响见图4。

图4 20%碳酸钠用量、反应温度、反应时间及福林酚稀释倍数对多酚测定结果的影响

由图4 可知，随着福林酚稀释倍数的升高，测得的三叶木通果皮提取物中的多酚含量逐渐降低。但是，当福林酚完全不稀释时，由于反应后的溶液中有白色沉淀析出，并伴随着大量气泡产生，因此根据试验并结合前期经验，最终决定将福林酚稀释2 倍使用[16]。

反应温度及20%碳酸钠用量对三叶木通果皮提取物的多酚测定的影响都是先上升后下降。当反应温度达到30 ℃，20%碳酸钠用量为1 mL 时，此时的多酚含量分别达到（18.25±0.13）mg/g 及（19.20±0.11）mg/g。当温度过高时，会使得结构不稳定的多酚分解，导致测定结果降低。碳酸钠过多会导致体系达到过碱状态，稀释蓝色络合物[17]。

三叶木通果皮提取物的多酚测定结果随着反应时间的延长，呈现先上升后下降的趋势，当反应时间达到110 min 时，多酚含量达到（18.22±0.17）mg/g。当反应时间过短，反应未充分进行。反应时间过长，可能会影响蓝色络合物，使得测得结果偏低[18]。

2.3 响应面结果分析

2.3.1 响应模型的建立与分析

利用Design Expert.V8.0.6.1 对选取的4 个因素进行响应面分析。通过二次多项式回归拟合，得到多酚含量（Y）。

由表4 可知，F=39.57，p＜0.0001，失拟项p=0.650 9，证明模型是合适的。该模型的R2=0.975 4，说明试验误差比较小，三叶木通果皮提取物的多酚测定条件结果和模型预测结果较一致。除此之外，该模型的校正系数R2Adj=0.950 7，也证明了模型的可靠性。

表4 方差分析

方差分析见表4。

各因素对多酚测定结果的响应面图见图5。

图5 各因素对多酚测定结果的响应面图

响应面分析图可以被用来评价设置的一些试验因素对三叶木通果皮提取物中总酚测定结果的两两交互作用[19]。由图5 可知，响应面坡度越陡，说明该因素对吸光度的影响越大，反之影响程度越小[20]。

2.3.2 最优条件的确定

根据响应面模型分析，通过Design Expert.V 8.0.6.1 得到的Folin-ciocalteu 分光光度法测量三叶木通果皮提取物中多酚含量的最优条件为福林酚稀释倍数0.63，20%碳酸钠用量1 mL，反应温度26.47 ℃，反应时间108.29 min，此时得到多酚含量为19.50 mg/g。参考最佳测定条件，在实际测定中对条件进行微调：将福林酚稀释倍数设为2 倍，20%碳酸钠用量设为1 mL，反应温度设为27 ℃，反应时间设为110 min，所得80%甲醇提取物中多酚含量的平均值为（18.91±0.38）mg/g，该结果略低于最佳条件下的最高值，但与预估值接近，吻合度达96.9%，说明在该条件下测三叶木通果皮提取物中的多酚含量较可靠。

3 结论

通过80%甲醇、60%乙醇和水3 种溶剂对三叶木通果皮进行超声提取及体外抗氧化试验证明，80%甲醇提取物的具有最强的FRAP 能力（20.51±0.02）mg/g，清除DPPH 自由基的能力（28.33±0.12）mg/mL，对Fe2+的络合能力（23.11±0.14）mg EDTA-2Na/g 及对·OH 引起的pBR322 质粒DNA 氧化损伤的保护能力。经响应面优化福林酚检测多酚的试验结果表明，80%甲醇提取物中多酚含量的平均值为（18.91±0.38）mg/g，确定的最优检测条件为福林酚稀释倍数设为2 倍，20%碳酸钠用量为1 mL，反应温度27 ℃，反应时间110 min。该研究为三叶木通果皮中多酚的提取与应用提供了参考，有利于三叶木通的进一步开发与利用。