杜仲橡胶颗粒的冷冻法提取及其形态性质研究

＊袁丹丹 张芬 郑泽轩 赵懿琛 王娟英 李岩*

（1.贵州大学生命科学学院 农业生物工程研究院 山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室 贵州 550025 2.贵州大学茶学院 农业生物工程研究院 贵州 550025）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）为杜仲科杜仲属落叶乔木，被列为国家二类保护树木，我国是现存杜仲资源的唯一保存地[1]。杜仲是我国传统的药用植物，也是世界适应范围最广的胶原植物[2]。杜仲胶颗粒主要存在于含胶细胞中，含胶细胞在杜仲树的根、茎、叶、皮、果实和种子等的维管束中均有分布，但各个部位的分布量并不一致[3]，其中，在叶片中的分布量为干重的3%～5%，在成熟果实中为10%～18%，在茎杆皮中为6%～12%，在根皮中为10%～12%，在种壳中为12%～18%[4-5]。杜仲胶颗粒的分离提取及纯化条件相对较为复杂，前期有不少学者针对杜仲胶颗粒的提取方法进行了研究，探索可适用于杜仲各器官中胶颗粒的提取工艺条件，对研究杜仲胶颗粒的功能具有重要意义[6]。本文选取了杜仲果实和叶片为实验材料，采用液氮研磨/离心法分离提取杜仲橡胶粒子，对橡胶粒子进行观察，并对翅果中橡胶粒子的分离提取与保存条件进行初步探索，为杜仲橡胶粒子的后续研究奠定基础。

1.材料与方法

(1)实验材料

植物材料取自2021 年9 月种植于贵州大学农业生物工程研究院实验农场杜仲资源圃中杜仲植株的叶片及翅果。

(2)试剂与仪器

试剂：提取液：100 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KF·2H2O、1% Vc、5 mmol/L MgSO4·7H2O、5 mmol/L巯基乙醇、2% PVP；漂洗液：100 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L MgSO4、10 mmol/L DTT；等渗溶液：10 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L 蔗糖。

仪器：分析天平、pH 计、光学显微镜、S3400 扫描电子显微镜、定角（45°）离心机。

(3)方法

①杜仲叶、翅果的采集与保存

采集健康、无病害的杜仲叶和翅果，分别平均分为2 份，一份放置于干燥避光的房间（15 ℃）保存，另一份放置4 ℃冰箱备用。

②杜仲胶丝的观察

光学显微镜观察胶丝：将杜仲果横向撕开，慢慢将胶丝置于载玻片上，于光学显微镜下观察。扫描电子显微镜观察胶丝：将杜仲果横向撕开，拉出胶丝保持紧绷的状态，粘在导电胶上，将胶丝镀金，于扫描电子显微镜下观察。

③橡胶粒子的提取与纯化

参照杨正伟等[6]的提取方法并略作修改。杜仲翅果100 g（或叶片100 g）放入研钵中，加入适量液氮研磨成粉末；将研碎后的粉末放入含有200 mL 缓冲液的烧杯中，于冰上搅拌为匀浆；将匀浆经100 目筛网过滤，并将滤液分装入4 ℃预冷的50 mL 离心管中，于4 ℃、6000 r/min 离心15 min；离心后，将提取液中的白色块状悬浮物尽可能多地转移到干净的离心管中保留备用；将得到的白色悬浮物置于冰上30 min，然后于4 ℃、12000 r/min 离心5 min，将上层白色悬浮物转移至其他离心管，并用漂洗液将橡胶粒子吹打至悬浮，再次离心，取上层胶颗粒，多次重复此步骤。此时得到的即为纯化后的橡胶粒子。

④橡胶粒子的观察与测量

光学显微镜观察：取纯化后的橡胶粒子（约0.1 g），添加到1 mL 漂洗液中，摇匀形成浊液，取一滴制片，于光学显微镜下观察并拍照。扫描电子显微镜观察：提取杜仲翅果纯化后的橡胶粒子（0.1 g），加入1.5 mL 扫描电镜固定液，室温下固定2 h，取一滴固定好的胶粒悬浮液滴在锡箔纸上，室温下干燥过夜。经用日立e-1010 离子溅射仪镀金后，用S3400 扫描电子显微镜观察。利用MATLAB R2016 a 软件，录入代码，输入光学显微镜下叶片和翅果橡胶粒子的图片，对图片中橡胶粒子直径进行测量统计。并计算提取的橡胶粒子的完好率：杜仲橡胶粒子提取完好率=形态完好的橡胶粒子个数/总的橡胶粒子个数。

⑤对不同储存条件下的杜仲翅果提取橡胶粒子

对分别在15 ℃房间与4 ℃冰箱中保存14 d 的杜仲翅果采用1.3.3 方法提取橡胶粒子，于光学显微镜下观察，并计算提取的橡胶粒子的完好率。

⑥采用不同研磨条件提取杜仲翅果中的橡胶粒子

采用1.3.3 方法分别获取添加液氮研磨的橡胶粒子和不加液氮研磨所得的橡胶粒子，于光学显微镜下观察，并计算提取的橡胶粒子的完好率。

⑦橡胶粒子的保存

将提纯后的橡胶粒子分别保存于提取液、漂洗液、等渗溶液、去离子水中7 d，于光学显微镜下观察。

2.结果与分析

(1)胶丝的观察

利用光学显微镜观察杜仲翅果的白色胶丝，可以观察到胶丝中有细长的含胶细胞，橡胶粒子存在于含胶细胞中(图1-a）；在扫描电镜下观察到胶细胞由于含有橡胶粒子而出现膨胀（图1-b）。

图1 （a）杜仲翅果胶丝的光学显微镜观察；（b）为杜仲翅果胶丝的扫描电镜观察

(2)杜仲叶片和翅果中橡胶粒子的观察

对杜仲叶片（图2-a）和翅果中（图2-b）的橡胶粒子进行光学显微镜观察，并对翅果中橡胶粒子进行扫描电子显微镜观察（图2-c），同时利用MATLAB R2016 a软件分析统计橡胶粒子大小。分析发现叶片中的橡胶粒子数量较少，直径跨度小，为1.5～7.0μm，大小均一，橡胶粒子容易聚集，有25.5%（270/1059）保持了原有形态特征；而翅果中橡胶粒子数目较多，直径跨度大，为1.0～16.6μm，橡胶粒子之间较分散，有56.0%（597/1065）的橡胶粒子保持了原有形态特征，在扫描电镜下翅果中橡胶粒子呈球形。

图2 （a）光学显微镜下杜仲叶片中的橡胶粒子；（b）光学显微镜下杜仲翅果中的橡胶粒子；（c）扫描显微镜下杜仲翅果中的橡胶粒子

(3)不同研磨方法下杜仲翅果中橡胶粒子的形态观察

分别于光学显微镜下观察有无液氮存在下研磨提取得到的橡胶粒子的形态，发现加入液氮研磨提取的橡胶粒子，有56.0%（625/1116）保持原始形态（图3-a）。常温研磨提取的橡胶粒子发生了比较严重的变形，仅2.9%（35/1200）保持原始形态（图3-b）。

图3 （a）加入液氮提取的翅果橡胶粒子；（b）直接研磨提取的翅果橡胶粒子

(4)不同储存条件下杜仲翅果中橡胶粒子的形态观察

于光学显微镜下观察分别在4 ℃冰箱（图4-a）与15 ℃房间中（图4-b）储存14 d 的杜仲翅果中的橡胶粒子的形态，发现储存于4 ℃冰箱中翅果的橡胶粒子有65.9%（990/1503）保持了原始形态，储存于15 ℃房间中翅果的橡胶粒子仅有18.4%（111/603）保持原始形态。

图4 （a）4 ℃冰箱保存14 d 后的翅果橡胶粒子；（b）为15 ℃室温保存14 d 后的翅果橡胶粒子

(5)不同保存条件下的橡胶粒子的形态观察

将保存于4 种不同溶液的橡胶粒子置于光学显微镜下观察，试验发现：保存于漂洗液的橡胶粒子基本没有凝聚变形的情况（图5-a）；保存于去离子水（图5-b）和提取液（图5-c）中的橡胶粒子有小部分发生了凝聚变形；保存于等渗溶液中的橡胶粒子发生了较严重的凝聚变形（图5-d）。

图5 （a）于漂洗液中保存7 d 后的橡胶粒子；（b）于去离子水中保存7 d 后的橡胶粒子；（c）于提取液中保存7 d后的橡胶粒子；（d）于等渗液中保存7 d 后的橡胶粒子

3.结论与讨论

杜仲胶颗粒是一类积累在杜仲含胶细胞中的细胞器，广泛存在于杜仲果实、叶片等器官中[7]。本实验利用MATLAB 软件对叶片和翅果中的橡胶粒子进行自动化测量，发现杜仲叶片中的橡胶粒子数目较少，直径跨度小，而杜仲翅果中的橡胶粒子则相反，表明杜仲翅果中的胶含量更多，这与已有的研究结果一致[8-9]。将杜仲翅果与巴西橡胶树[10]中的胶粒子进行比较发现，杜仲翅果橡胶粒子几乎为圆球形，而巴西橡胶树中的胶粒子还有椭圆形和梨形；巴西橡胶树胶粒子直径为0.2～10μm，而杜仲中翅果橡胶粒子直径可达16.6μm。对杜仲翅果中的橡胶粒子的分离提取与保存条件研究显示，保存在4 ℃冰箱的翅果中橡胶粒子形态更加完整，这是因为相较于室温下储存，试验储存于4 ℃冰箱中杜仲翅果失水较少，从而对橡胶粒子的损害更小。在研磨时加入液氮，可以使提取的橡胶粒子更接近天然形态，若在常温下研磨，会使胶丝受到挤压而变形，从而破坏橡胶粒子形态结构。在漂洗液中保存的橡胶粒子基本没有凝聚变形的情况，能较好地保持橡胶粒子的原始状态。本研究的试验结果可为后续杜仲橡胶粒子的研究提供参考。