中草药山茱萸中花色苷的提取方法研究

＊张珊 邢昭晔 焦晓燕

（河北北方学院 河北 066000）

我国中医传统历史悠久，目前中草药的应用日益广泛。为了更好的发挥中草药的药用、经济价值，并在化学实验教学中渗透中草药提纯与分析方法，中草药成分的提纯与分析方法研究已经成为一项重要课题。在众多中草药成分提纯技术中，膜分离技术[1]、高效液相色谱分析技术[2]、光纤红外光谱[3]等已经被广泛应用。

山茱萸含有多糖、环烯醚萜类、苷类等[4]物质，其提取方法有溶剂萃取法[5-6]、水提法[7]和超临界流体法[8]，相比而言，溶剂萃取法具有简捷高效、操作简单的特点[9]。花色苷提纯方法主要有色谱法、大孔树脂纯化法等，大孔树脂法由于其价廉、简捷的特点而被应用于中草药成分纯化中[10]。测定花色苷含量常用的方法有色价法[11]、pH 示差法[12]以及高效液相色谱法[13]，其中应用最广泛的是pH 示差法[14]，该方法具有较高的准确度、灵敏度较高等优点[15]。

1.试验部分

（1）试验试剂。三氟乙酸（分析纯、天津市津东天正精细化学试剂厂）、甲醇（分析纯、天津市化学试剂三厂）、氯化钾（分析纯、天津市化学试剂三厂）、醋酸钠（分析纯、天津市化学试剂三厂）、醋酸（分析纯、天津市津东天正精细化学试剂厂）、盐酸（分析纯、天津市津东天正精细化学试剂厂）、氢氧化钠溶液（分析纯、天津市化学试剂三厂）、山茱萸（丽天承 北京同仁堂）、D101、AB-8、HPD700、HPD100 树脂。

（2）试验仪器。U-3900 紫外分光光度计、721 可见分光光度计、旋蒸仪（上海亚荣生化仪器厂）、粉碎机（RS-FS1401 荣事达）、空气浴恒温摇床（THZ-82 金坛区金城春兰实验仪器厂）、HH 系列数显水浴锅（金坛市科析有限公司）、磁力搅拌器（金坛区白塔新宝仪器厂）、GD 系列无线pH 传感器。

（3）预实验。本实验采用三氟乙酸甲醇溶液提取山茱萸花色苷，将山茱萸粉碎，称取5.0 g 于200 mL锥形瓶中，加入100 mL 3% TFA，在30 ℃的恒温水浴锅中浸提0.5 h，取粗提取液50 mL，选用AB-8 树脂进行纯化。然后用旋蒸仪减压浓缩除去三氟乙酸甲醇溶液，最后用去离子水稀释到100 mL，测定其在可见光区的最大吸收波长λ 及在此波长下的吸光度A。

（4）探究溶剂萃取法的提取条件。在预实验的基础上，依次探究提取温度、提取时间、提取剂浓度、提取剂pH 和物料比等提取条件对山茱萸花色苷提取的影响。

称取山茱萸2.0 g 于100 mL 锥形瓶中，加入25 mL 3% TFA，用盐酸将pH 值调至2，置于恒温水浴锅中，浸提1 h，温度为20 ℃。用可见分光光度计测提取液A510nm。首先，称取山茱萸2.0 g 于100 mL 锥形瓶中，温度变量设为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃；第二次调整时间变量，设为1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h；第三次调整三氟乙酸甲醇的浓度变量，设为1%、2%、3%、4%、5%；第四次调整pH 值变量，设为1、2、3、4；最后调整物料比（m/v）变量设为2 g:20 mL、2 g:30 mL、2 g:40 mL、2 g:50 mL，分别用可见分光光度计测提取液A510nm。

（5）对花色苷粗提取液进行纯化。本实验选取D101、AB-8、HPD700、HPD100 树脂对山茱萸花色苷进行纯化。通过实验选择效率最高的，为下面实验测定山茱萸花色苷含量做准备。

①对大孔树脂进行预处理。称取D101 大孔树脂5.0 g，在3%三氟乙酸甲醇中浸泡24 h，用蒸馏水洗涤，再用3%三氟乙酸甲醇淋洗，其余树脂的预处理实验步骤同上。

②筛选纯化效果最佳的大孔树脂。称取1.0 g 树脂，加入10 mL 粗提取液，在空气浴恒温摇床中吸附24 h，用可见分光光度计测定上清液吸光度，吸附率和解吸率分别按下式计算。

式中：A0—初始吸光度；A—吸附后吸光度；E—吸附率[16]。

称取0.2 g 树脂，再加入10 mL 3%三氟乙酸甲醇溶液，在110 r/min 的空气浴恒温摇床中，温度控制在25 ℃，解吸12 h。

式中：D—解吸率；A1—解吸后吸光度。

（6）运用pH 示差法测定山茱萸花色苷的含量[17]。分别将取纯化后的提取液中加入到pH 为1.0 和pH 为4.5 缓冲液中，分别测定A510nm和A700nm。花色苷含量按下式计算。

式中：C—花色苷质量浓度（mg/L）；A—花色苷总吸光度；DF—稀释倍数；M—花色苷分子量；V—提取液的总体积（mL）；m—称取的山茱萸质量（g）；E—花色苷摩尔消光系数[18]。

矢车菊素-3-O-β-吡喃型半乳糖苷：M-449.2（mg/mol）、E-26900（mol-1）。

2.结果与分析

(1)对山茱萸花色苷紫外吸收光谱进行结果分析

山茱萸，红色至紫红色,富含花色苷类物质。由图1 可知，提取液的最大吸收波长为510 nm，最大吸光度为0.011。花色苷在可见光区的特征吸收峰在500～530 nm 之间，说明510 nm 为山茱萸提花色苷提取的测定波长。

图1 山茱萸花色苷紫外可见吸收光谱图

(2)用单因素试验探究溶剂萃取法提取山茱萸的条件

由图2～图6 可知，山茱萸花色苷的最佳提取条件为：3%三氟乙酸甲醇溶液，物料比2 g:30 mL，pH为2，60 ℃水浴3 h。

图2 提取温度对山茱萸花色苷提取的影响

图3 提取时间对山茱萸花色苷提取的影响

图4 提取剂浓度对山茱萸花色苷提取的影响

图5 提取剂pH 对山茱萸花色苷提取的影响

图6 物料比对山茱萸花色苷提取的影响

(3)对大孔树脂的吸附率和解析率进行结果分析

由表1 可知，吸附率和解吸率最高的是AB-8 大孔树脂，其纯化效果最好。AB-8 大孔吸附树脂具有高效、高选择性、高稳定性和易操作等优点。所以在后续测定山茱萸花色苷的定量分析的实验中选择AB-8 大孔树脂进行纯化。

表1 大孔树脂的吸附率和解吸率

(4)pH示差法测定山茱萸花色苷含量的结果分析

当pH 为1 时，提取液A510nm为0.485，A700nm为0.225；当pH 为4.5 时，提取液A510nm为0.281，A700nm为0.143。经式（1）～（3）和式（1）～（4）计算得花色苷的浓度为0.041 mg/g。

3.结论与启示

本研究以中草药山茱萸为原料提取花色苷，创新性的选择三氟乙酸甲醇溶剂萃取法，采用单因素试验探究提取条件对三氟乙酸甲醇溶剂萃取花色苷的影响。经过三氟乙酸甲醇溶剂萃取法得到山茱萸花色苷的粗提取液，选择大孔树脂纯化粗提取液，根据结果分析可知AB-8 树脂纯化效果最好。选取pH 示差法对纯化后花色苷浓度进行测定，根据公式得出山茱萸花色苷的浓度为0.041 mg/g。我国的中医传统历史悠久，中医药学经历了五千年的继承与弘扬。

本研究为天然花色苷在食品工业、医药、化妆品等领域的应用提供了方法，为山茱萸资源的高值化利用提供了科学试验依据。