伊曲康唑对人血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的体外研究

夏爱晓 贾宇 林群 曹明 蒋正立

婴幼儿血管瘤是常见的良性肿瘤，由胚胎时期血管增生形成，好发皮肤和皮下组织，60%发生在头颈部［1］，其次四肢和躯干［2］，发病率为3%～10%［3］。临床上婴幼儿血管瘤治疗，一般以外科手术较多，但手术需麻醉，且激光治疗有严重的副作用等缺点［3］。药物治疗相对患者依从性较高，目前主要还是β受体阻滞剂，如口服普萘洛尔，局部用噻吗洛尔等［4］。CHONG等［5］首先报道伊曲康唑有抗血管生成作用，发现伊曲康唑可体外抑制血管内皮细胞（HUVEC）分裂，使其阻滞在G1期，同时在体内抑制血管内皮生长因子（VEGF）和纤维上皮生长因子（FGF）依赖的血管生成作用，作用靶点可能为羊毛甾醇14-去甲基化酶。在人脐静脉内皮细胞中，伊曲康唑通过与Niemann-PickC蛋白结合抑制细胞内胆固醇向质膜的转运，导致胆固醇耗竭［6］。但目前伊曲康唑对人血管瘤内皮细胞（human hemangioma endothelial cells lines，HemECs）作用机制尚未明确［7］，故本实验探究不同浓度伊曲康唑对HemECs的抑制作用和细胞凋亡的影响，为后期伊曲康唑治疗血管瘤研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 CKX41生物显微镜（奥林巴斯）； SC-3616低速离心机（安徽中科中佳）；CO2培养箱（赛默飞世尔）；OptiMair垂直流超净工作台（新加坡艺思高Esco）；5424R小型高速冷冻离心机（艾本德）；Multiskan FC带孵育器酶标仪（赛默飞世尔）；-80℃超低温冰箱（赛默飞世尔）；CytoFlex S流式细胞仪（贝克曼库尔特）。

1.2 材料 人血管瘤内皮细胞（HemECs）（华山医院中心实验室），伊曲康唑（武汉梦奇科技有限公司，批号：190801，纯度：99.2%），胎牛血清（HAKATA，S201905），DMEM高糖完全培养基（HAKATA，批号：WP20201124），细胞冻存液（BioFlux，批号：20180602），胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）（索莱宝，批号：20210201），青-链霉素混合液（双抗）（Gibco，批号：01750），CCK-8试剂盒（Bioss ANTIBODIES，批号：BJ05203090），Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒（北京四正柏，FXP023）。

1.3 HemECs培养 人血管瘤内皮细胞（HemECs）用含10%的胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃，5% CO2饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行试验。

1.4 细胞形态观察 将适量的细胞接种于6孔板上，体外培养的HemECs经不同浓度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL）伊曲康唑干预（12 h、24 h、48 h）后，不同浓度不同时间倒置显微镜观察伊曲康唑对HemECs形态和凋亡的影响。

1.5 CCK-8法实验检测细胞活力和抑制率 取对数生长期HemECs细胞接种于96孔板中，每孔5×103个细胞，每孔100 μL，贴壁后分别给予10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL伊曲康唑完全培养基混合液，继续培养至12 h、24 h、48 h。对照组加入无药物的DMEM完全培养基。每组均设置5个复孔。分别在每孔100 μL细胞悬液中加入CCK-8溶液，继续培养至2 h，酶标仪检测，酶标仪测波长450 nm吸光度A值。实验组与对照组均减去空白组吸光度A值，各组取去掉最大值和最小值的平均数，代入下列公式，即得细胞抑制率。抑制率= ［（Ac-As］/（Ac-Ab）］×100%；As：实验孔（含有细胞的培养基、CCK8、伊曲康唑）；Ac：对照孔（含有细胞的培养基、CCK8）；Ab：空白孔（不含细胞和伊曲康唑的培养基、CCK8）。

1.6 流式细胞术检测HemECs细胞凋亡 将HemECs制成单细胞悬液接种于6孔板上继续培养，每隔1～2 d换液，待细胞铺满瓶底80%以上，将HemECs分为实验组、对照组。实验组伊曲康唑浓度（30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL）干预后（12 h、24 h），收集细胞培养液，并用不含EDTA的胰酶消化细胞，离心（1,000 r/min，5 min）。加入约1 mL 4 ℃预冷的PBS漂洗，重悬细胞，再次离心沉淀细胞（直至上清液无色）。加入100 μL 1×BindingBuffer重悬细胞，调节细胞浓度为1～5× 106/mL［8］；将需要加碘化丙锭溶液（PI）的组别中加入10 μL的PI，需要加Annexin V/FITC的组别中加入5μL的Annexin V/FITC，混匀后于室温避光下孵育5 min，立即上机检测［9］。空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/FITC和PI；单染管：阳性对照组细胞，只加Annexin V/FITC；PI单染管：阳性对照组细胞，只加PI；双染管（检测管）：处理的细胞，加Annexin V/FITC和PI。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态观察 伊曲康唑各作用时间的HemECs形态结果显示，当伊曲康唑浓度为10 μg/mL、20 μg/mL与空白组比较变化较小，对HemECs影响较小。在12 h、24 h、48 h结果中可发现从30 μg/mL至50 μg/mL HemECs的数量和密度显著减小，且在50 μg/mL中大部分HemECs均已经成为凋亡小体。结果表明30 μg/mL伊曲康唑的作用最适合。见图1、2、3。

图1 伊曲康唑各浓度作用12 h后HemECs形态（光镜×100）

图2 伊曲康唑各浓度作用24 h后HemECs形态（光镜×100）

图3 伊曲康唑各浓度作用48 h后HemECs形态（光镜×100）

2.2 CCK-8法实验检测细胞活力和抑制率 与空白组比较，伊曲康唑可以显著抑制HemECs的增殖。且在伊曲康唑分别干预12 h、24 h、48 h后，CCK-8对HemECs细胞增殖抑制具有伊曲康唑浓度依赖性，且抑制率差异有统计学意义（P＜0.05）。且在30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL间抑制率差异最显著。伊曲康唑作用24 h后各浓度梯度的抑制率变化趋势（k=0.1038）比12 h（k=0.0054）和48 h（k=0.0617）更明显。干预48 h的抑制率最高、细胞活力最低，24 h比12 h的抑制率显著。在伊曲康唑为40 μg/mL、50 μg/mL的情况下，干预12 h、24 h、48 h的HemECs抑制率明显增强、细胞活力降低。筛选12 h和24 h浓度为30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的伊曲康唑为流式细胞术的条件。见图4。

图4 伊曲康唑各浓度作用不同时间后对HemECs细胞抑制率影响

2.3 流式细胞术检测HemECs细胞凋亡 HemECs细胞凋亡有伊曲康唑浓度依赖性，干预12 h后，浓度30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL细胞总凋亡率分别为2.65%、7.27%、9.83%；干预24 h后，浓度30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL细胞总凋亡率分别为4.61%、13.09%、17.95%。结果显示，干预12 h随着浓度的提高，细胞凋亡率的增加；且在相同浓度下，干预24 h的细胞凋亡率比12 h高，抑制更有效，见图5-6。

图5 伊曲康唑作用12 h后HemECs细胞凋亡散点图

图6 伊曲康唑作用24 h后HemECs细胞凋亡散点图

3 讨论

伊曲康唑是一种广谱抗真菌药物，半衰期较长、分布容积高、组织浓度稳定；临床应用相对较安全，也具一些罕见的副作用，包括中性粒细胞减少，肝和心脏功能衰竭；通常被用于治疗真菌感染，近几年伊曲康唑对血管瘤、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胆道癌和急性白血病作用逐渐被报道，如伊曲康唑联合化疗可逆转紫杉烷耐药性，提高生存率［10］。冉玉平［11］研究认为伊曲康唑具有抗血管瘤作用，6位患有血管瘤的婴儿口服伊曲康唑5 mg/（kg·d），给药约3个月，治疗结束时改善80%～100%；1例局部湿敷马来酸噻吗洛尔滴眼液3个多月无效，后改为口服伊曲康唑口服液，疗程68 d，总用量2300 mg，停药时血管瘤已有消退征象，停药4个月后血管瘤几乎消退，表明伊曲康唑治疗有后效应；这明显快于血管瘤自然消退速度，也短于普萘洛尔疗程。YANG等报道［12］，2个月男孩，左侧阴囊血管瘤上有溃疡40 d，ITZ口服液治疗婴儿血管瘤溃疡，治疗60 d，血管网大部分消退，停药3个月后有明显改善。LI等［13］报道普萘洛尔和伊曲康唑对婴幼儿血管瘤细胞作用，伊曲康唑治疗（有效率44.4%）高于普萘洛尔组（有效率22.2%），血清血管生成素Ⅱ水平均有下降，其抗血管瘤机制与诱导血管内皮细胞凋亡和自噬有关，使血管瘤缓慢消退。

综上所述，伊曲康唑对HemECs细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡促进作用与浓度、作用时间呈正相关，当伊曲康唑浓度≥30 μg/mL时，作用效果显著增强，且呈浓度依赖性。伊曲康唑浓度≥30μg/mL、干预时间为24 h，作用效果最为适合。