探讨坤泰胶囊治疗卵巢早衰的作用机制*

于秋敏，伍娟娟

1 广西中医药大学 广西南宁 530200

2 广西中医药大学附属瑞康医院 广西南宁 530011

卵巢早衰（ POF，premature ovarian failure ）是妇科病中常见的生殖内分泌疾病，好发于40岁以前的女性，以闭经、促卵泡生成素（FSH）≥40mIU / mL、雌激素水平降低伴或不伴有不同程度的围绝经期症状为主[1]。据国外文献报道[2]，随着女性生活和工作压力的逐渐升高，全球POF患病率呈逐年上升的趋势，POF的全球发病率约0.9%～1.2%。治疗POF，西医常用激素补充疗法，虽对患者的症状有改善作用，但停药后易复发，且易增加女性患癌风险[3]。坤泰胶囊由古代医家张仲景《伤寒杂病论》中的“黄连阿胶汤”加减而成；在临床上，坤泰胶囊作为治疗POF的一线中成药运用相当广泛[4]。

本文基于网络药理学方法探讨坤泰胶囊治疗POF的主要药物活性成分、关键靶点以及相关通路，再用分子对接技术对得到的关键靶点与核心药物成分进行对接研究，对关键靶点-核心成分两者结合能的结果进行分析，为后续坤泰胶囊治疗POF的作用机制提供临床参考。

材料与方法

1 坤泰胶囊药物活性成分及相关靶点的获取

在TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php/），以口服利用度≥30%、且满足类药性≥0. 18为筛选标准，检索坤泰胶囊六味中药的活性成分，因阿胶在该数据库中未检索到，则在BATMAN-TCM数据库（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）补充检索。通过Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/），进行蛋白质靶点名称的标准化处理。

2 POF疾病靶点的获取方法

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）与OMIM（https：//omim.org/）数据库以“premature ovarian failure”为关键词，进行疾病靶点的检索。

3 构建“药物-活性成分-相关靶点”网络图

将所得的药物及其活性成分、相关靶点，导入Cytoscape3.8.0软件中，进行“药物-活性成分-相关靶点”网络图的构建。

4 获取药物与疾病的交集靶点

将所得的药物与疾病靶点蛋白数据，输至Bioinformatics（https：//bioinformatics.com.cn/）中，得药物与疾病的交集靶点。

5 构建“蛋白与蛋白相互作用（PPI）”网络图

将所得“交集靶点”，导入STRING数据库（https：//cn.string-db.org/），得到蛋白互作结果。所得的蛋白互作结果以“tsv”格式导入Cytoscape3.8.0软件中，构建PPI可视化网络图。

6 GO富集分析及KEGG通路分析

通过DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），对“交集靶点”，进行生物过程（BP ）、细胞组成（CC）、分子功能 （ MF）及KEGG通路的分析。取GO富集分析中BP、CC、MF前10个数据结果和KEGG通路分析前20个数据数据可视化展示。

7 核心药物活性成分与核心靶点分子对接验证

从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中获得药物活性成分的2D分子结构，Chem3D软件中优化成3D结构，作为配体；用Pymol软件对核心靶点进行去水、去残积等处理，作为受体。用Autodock tools与Autodock Vina对核心药物活性成分与核心靶点进行分子对接验证，并计算出对应的结合能值。最后，用Pymol软件对结合能值排名前6的进行可视化展示。

结果

1 坤泰胶囊药物活性成分及相关靶点

在TCMSP与BATMAN-TCM数据库中检索，得到黄芩36个、茯苓15个、黄连14个、白芍13个、熟地黄2个及阿胶3个。最后将所得的药物活性成分进行去重，共88个药物活性成分纳入研究范围。该88个药物活性成分共得到219个药物相关靶点，在Uniport数据库中对219个药物相关靶点进行蛋白名称的标准化处理。

2 POF疾病靶点的获取结果

在GeneCards数据库以“Relevance score>3.76”作为筛选标准，获疾病靶点5081个，筛选出2543个与疾病紧密相关的靶点。OMIM数据库所获得的疾病靶点491个，将两数据库所得的靶点进行合并去重，最终得到疾病靶点2947个。

3 “药物-活性成分-相关靶点”网络图

利用Cytoscape3.8.0软件构建“药物-活性成分-相关靶点”网络图，包括290个节点和959条边，见图1，利用软件中“Network Analyzer”插件，进行拓扑参数分析，取度值排名前7的药物活性成分作为坤泰胶囊的关键成分，见表1。

表1 关键药物有效成分基本信息

图1 “药物-活性成分-相关靶点”网络图

4 药物与疾病的交集靶点

通过Bioinformatics平台，得到153个交集靶点，包括PTGS2、PTGS1、NOS1、PGR、NR3C2、TNF、IL6、CD14、LBP、PIK3CG等。交集靶点韦恩图见图2。

图2 坤泰胶囊治疗POF的共同靶点韦恩图

5 “蛋白与蛋白相互作用（PPI）”网络图

经STRING数据库得PPI网络图，以“tsv”格式导入Cytoscape3.8.0软件中，进行可视化展示，用CytoNCA插件对网络图进行拓扑分析，筛选出均满足数值大于介数中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）中位数前10的节点为核心靶点，这些核心靶点可能是坤泰胶囊治疗POF的关键靶点，见图3与表2。

表2 核心靶点的拓扑分析结果

图3 “蛋白与蛋白相互作用”网络图

图4 坤泰胶囊对POF作用靶点的GO富集分析图

图5 坤泰胶囊对POF KEGG通路分析图

6 GO富集分析及KEGG通路分析

GO富集分析检索到1012个条目，分别选富集靶点排名前10的进行可视化。BP得778个条目，包括雌二醇的反应、缺氧的反应等；CC得84个条目，包括膜筏、细胞外、细胞液等；MF得150个条目，涉及酶结合、蛋白结合、相同的蛋白结合等。KEGG通路分析检索到169条通路，选富集前20的通路进行可视化，见图6，其主要涉及癌症通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等信号通路。

图6 分子对接结果可视化

7 核心药物活性成分与核心靶点分子对接验证

选前5的核心药物活性成分与前8的核心靶点进行分子对接验证，对接的结合能信息表见表3。结合能信息表均＜-5.0 kcal/mol，体现了分子对接的配体与受体能稳定的结合，表明了坤泰胶囊的核心药物活性成分能很好的与预测的核心靶点结合在一起。对结合能值排名前6的分子对接结果进行可视化展示，见图6。

表3 坤泰胶囊核心活性成分与核心靶点的分子对接结果

讨论

本研究通过网络药理学的方法对坤泰胶囊治疗POF的药物及潜在靶点进行预测，从而证实坤泰胶囊对POF起到治疗作用，揭示了坤泰胶囊通过多成分、多靶点、多通路对POF的作用机制。

“药物-活性成分-相关靶点”网络图，按拓扑分析中度值参数筛选出槲皮素、β-谷固醇、山萘酚、豆甾醇、黄芩素、黄芩苷作为坤泰胶囊治疗POF的核心药物成分。槲皮素、β-谷固醇与豆甾醇均有抗衰老、抗抑郁、抗氧化等药理活性[5-6]，均能调控 PI3K/Akt信号通路，对卵巢起到抗氧化、抗细胞衰老等作用进而减慢或抑制卵巢细胞的衰老过程，促进卵巢各级卵泡的生长发育[7-8]，使颗粒细胞繁殖，抑制细胞凋亡，保持卵巢功能的活性[9-10]，从而发挥对卵巢功能的调节作用[11-12]。研究发现，山萘酚在一定程度上能改善癌SKOV-3细胞在体外的增殖，使卵巢癌细胞凋亡，恢复卵巢的再生功能[13-14]。黄芩素与黄芩苷均属黄酮类化合物，有抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤等药理作用[15]，有实验证明，二者能提高抗氧化酶的浓度，抑制小鼠卵巢组织细胞损害的程度，从而对卵巢组织起到保护作用[16-17]。

通过PPI网络图进行CytoNCA拓扑分析，发现坤泰胶囊能通过TP53、AKT1、MAPK1、TNF、IL6等核心靶点对POF发挥治疗作用。TP53能通过刺激ASK1信号通路使卵巢颗粒细胞增殖和凋亡，促使卵巢卵泡的产生和发育，减轻卵巢早衰的症状[18-19]。AKT1能激活卵巢组织内自噬细胞从而抑制卵巢的衰老，延长卵巢细胞寿命，反映了AKT1基因蛋白影响POF的进展[20]。TNF与IL6均属炎性因子，而POF的发生常常与炎性因子密切相关[21]；刁瑞英等人通过临床观察发现，POF患者血清中TNF、IL6等炎性因子水平偏高，用坤泰胶囊治疗POF患者，能通过调节TNF与IL6等炎症因子来改善自身免疫紊乱，调节患者内分泌系统，起到改善卵巢中卵泡的功能[22]。

通过GO富集分析和KEGG信号通路分析，证实坤泰胶囊能通过参与多种生物过程及调控多条信号通路对POF的进展发挥作用。KEGG信号通路分析结果中PI3K-Akt、TNF及IL-17等信号通路与POF紧密联系，PI3K-Akt信号通路参与卵巢卵母细胞的生长、原始细胞的发育及颗粒细胞增殖与分化等过程，在卵泡的生长发育与卵巢损伤的恢复起到关键调节作用[23-24]。实验证明，坤泰胶囊能调节小鼠体内的激素水平，下调Fasl蛋白与上调TNF蛋的mRAN的表达，从而促使卵巢功能得到修复，起到保护卵巢的作用[25-26]。IL-17信号通路属于炎症通路，坤泰胶囊联合激素贯序疗法能通过IL-17信号通路及调控Th17细胞平衡，对POF起到治疗作用[27-28]。由此可知，坤泰胶囊可通过多条通路途径改善卵巢早衰患者的卵巢功能变化，从而维持卵巢的生理功能。分子对接结果表明，坤泰胶囊的核心药物活性成分与核心靶点的平均结合能为-9.01kcal/mol，该结果证实了坤泰胶囊的药物活性成分能与核心靶点蛋白有较强的结合能力，揭示了主要药物活性成分对核心靶点蛋白有一定的激活或抑制作用，坤泰胶囊从而起到对POF起的治疗作用。

综上所述，坤泰胶囊治疗卵巢早衰能通过相关药物活性成分、核心靶点及相关通路对改善卵巢功能、延长卵巢细胞寿命、减轻卵巢早衰症状、调节体内激素水平等起到一定的作用。本文阐明了坤泰胶囊治疗卵巢早衰的药理作用机制，不足之处在于缺少实验的验证，但本文能为临床研究、实验研究以及中药的开发提供一些新思路。