黄连素通过重塑肠道菌群和调节PI3K/AKT信号通路改善多囊卵巢综合征小鼠的作用机制研究

杨宇琦,吴丽娜,孙克,邢伟园,侯越,张丽文

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是女性最常见的生殖内分泌疾病,也是育龄期女性不孕的重要原因[1]。PCOS发病机制较为复杂,其治疗方法具有局限性。因此,寻找有效的治疗药物至关重要。黄连素(berberine,BBR)是一种天然异喹啉生物碱,具有降糖、降脂和抗炎等有益作用。据报道,BBR对PCOS显示出良好的临床疗效[2],但其具体机制尚未可知。研究表明,肠道菌群及其代谢产物失调与PCOS的生殖和代谢表型存在联系[3-4],靶向调节肠道菌群可改善PCOS[5-6]。由于BBR吸收率低,其分解代谢主要集中在胃肠道,可能有效调节肠道菌群和肠道黏膜屏障[7]。因此,本研究采用来曲唑诱导的PCOS小鼠模型,利用16S rDNA基因测序技术,研究BBR对PCOS肠道菌群的调节作用及可能机制,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物:清洁级健康雌性C57BL/6J小鼠24只,6～8周龄,体质量15～20 g,由北京华阜康生物科技股份有限公司提供,合格证号:SCXK(京)2020-0004。饲养在特定的无菌条件下,标准温度(22±2)℃,相对湿度45%～70 %,光暗周期12/12 h,并给予自由饮水和标准饮食。屏障环境适应1周后进行后续实验。(2)试药试剂:来曲唑(货号H199991001)购自江苏恒瑞医药公司;达英-35(货号j20140114)购自德国拜耳公司;黄连素(批号B21449)购自上海源叶生物公司;睾酮(T,货号H090-1-1)、雌二醇(E2,货号H102-1-1)和促黄体生成素(LH,货号H206-1-2)购自南京建成公司;空腹胰岛素(FINS,货号ml060484)和卵泡刺激素(FSH,货号ml059034)ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物公司;HE检测试剂盒(货号G1003)购自武汉塞维尔生物公司;抗Occludin(GB111401)、Claudin-1(GB14066)抗体购自美国Servicebio公司;抗PI3K(4255S)和PI3K-p85(4292S) 抗体购自美国CST公司;抗AKT(ab8805)和AKT-pT30磷酸化抗体(ab32445)购自美国Abcam公司。(3)仪器设备:离心机(AXTGL16M)购自江苏恒诺仪器制造有限公司;切片机(RM2235)和石蜡包埋机(G1150H)购自德国徕卡公司;I-Sanger生信云平台(https://www.i-sanger.com/)。

1.2 PCOS模型构建及分组处理 2021年6月—2022年6月在复旦大学附属上海市第五人民医院实验动物中心进行实验。采用随机数字表法将24只雌鼠分为正常对照组、模型(PCOS)组、阳性药达英-35(0.2 mg·kg-1·d-1)组和BBR(100 mg·kg-1·d-1)组,每组6只。除正常对照组外,其余小鼠均予以来曲唑(1 mg·kg-1·d-1,溶于1%羧甲基纤维素)灌胃诱导PCOS模型,连续21 d,正常对照组给予等容积0.9%氯化钠溶液。以第1次给来曲唑为第1天计算,第8天开始连续每日取小鼠阴道上皮细胞涂片观察脱落细胞改变,分析动情周期变化,以阴道上皮细胞持续角化者为造模成功。造模成功后,第22天开始给予相应剂量药物连续灌胃治疗14 d,正常对照组和PCOS组给予等容积0.9%氯化钠溶液。实验期间,每周监测小鼠体质量。实验结束后,禁食10 h后过量麻醉处死,收集血清、双侧卵巢和结肠作进一步分析。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 16S rDNA基因测序检测各组小鼠肠道菌群变化:实验结束后,收集各组小鼠粪便样本,按照文献[8]报道方法,从小鼠粪便样本中提取微生物基因组DNA。PCR扩增方法如下:98℃ 2 min,随后在98℃ 15 s,55℃ 30 s, 72℃ 30 s下循环25次,最后在72℃延伸5 min。使用正向引物338 F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3')和反向引物806 R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')在72℃下进行最终延长5 min,制备文库(连接接头和指示剂)和纯化。微生物组生物信息学采用QIIME2 2019.4进行,并根据官方教程(https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)进行轻微修改。基于操作分类单元(OTU)注释,结合门、纲、目、科、属等分类水平,生成相对丰度谱。采用Pearson相关系数矩阵进行UPGMA聚类,并在R统计软件包中开发自定义脚本生成热图,对差异较大的每个类群或OTU进行评价。

1.3.2 血清激素水平测定:各组小鼠末次给药后,于眼眶后静脉丛采血0.5～1.0 ml,室温静置2 h后,4℃离心收集上层血清。利用酶联免疫吸附法并按照试剂盒说明书检测血清激素水平:T、E2、FSH、LH和FINS。

1.3.3 胰岛素代谢相关指标测定:上述血液以 Hitachi-7600自动生化分析仪测量空腹血糖(FPG);分别根据公式[FINS(μIU/ml)×FPG (mmol/L)/22.5]和1/[FPG (mmol/L) × FINS(μIU/ml)]计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感系数(ISI)。

1.3.4 HE染色检测小鼠卵巢病理结构:取各组小鼠卵巢组织,4℃下以4%多聚甲醛固定48 h,常规石蜡包埋,切片厚5 μm。利用HE染色试剂盒,并按照说明书步骤行HE染色。光镜下评估创面组织形态学变化。

1.3.5 结肠Occludin、Claudin-1表达:将结肠组织切片放入65℃烤箱烘烤30 min后,二甲苯脱蜡,酒精梯度复水。在0.01 mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中煮沸20 min,抗原修复。3% H2O2封闭切片5 min后,室温下山羊血清封闭15 min,分别用紧密连接蛋白Occludin和Claudin-1的特异性一抗(1∶200)4℃下孵育过夜;次日,用生物素标记的山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶在室温下各孵育15 min。3,3'二氨基联苯胺(DAB)显色5 min,苏木精复染。使用光学显微镜获得图像,阳性结果呈棕褐色,并进行蛋白定量分析。

1.3.6 Western-blot检测小鼠卵巢组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达:各组小鼠卵巢组织在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中进行裂解,并利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。20 μg卵巢蛋白经10% SDS-PAGE电泳分离,并在100 V下转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上60～80 min。非特异性结合点在室温下用 5%脱脂牛奶在三相缓冲盐水(TBS-T)中阻断1 h后,用 PI3K(1∶500)、p-PI3K(1∶300)、AKT(1∶500)、p-AKT(1∶300)和 β-actin(1∶5 000)的一抗孵育PVDF膜。次日,用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5 000)作为二抗,以β-actin为内参,采用Image J软件进行定量分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠肠道菌群丰度和多样性比较

2.1.1 OUT分析及物种组成分析:正常对照组、PCOS组、达英-35组和BBR组特有的OTU数分别为9 499(25.04%)、6 534(17.32%)、7 089(18.79%)和7 212(19.11%)。根据OUT聚类的结果,可获得4组小鼠在门、纲、目、科、属、种水平的丰度信息,见表1。

表1 4组小鼠肠道各级微生物分类群的数量

2.1.2 α多样性分析:正常对照组、PCOS组、达英-35组和BBR组小鼠肠道菌群的Simpson指数分别为0.986 2、0.472 3、0.887 6和0.978 4,Shannon指数分别为9.089 2、3.234 1、8.672 8和8.423 6,4组间Simpson和Shannon指数比较,差异有统计学意义(P<0.001)。

2.1.3 β多样性分析:剔除远离总体的部分样本后,非加权主坐标分析(PCoA)结果表明,4组肠道菌群组成有明显差异。Axis 1和Axis 2轴对结果的解释度分别为7.3%和5.5%,见图1。

图1 4组小鼠PCoA分析结果

2.1.4 物种差异分析:

2.1.4.1 门水平菌群丰度比较 4组小鼠肠道门水平菌群丰度比较(前20位),菌群组成以厚壁杆菌门和拟杆菌门为主。正常对照组、PCOS组、达英-35组和BBR组厚壁杆菌门占比分别为(72.54±2.36)%、(72.58±2.28)%、(76.81±3.23)%和(74.23±2.98)%,拟杆菌门占比分别为(25.87±1.67)%、(27.13±1.89)%、(21.67±1.62)%和(24.13±1.87)%。4组间厚壁杆菌门和拟杆菌门丰度比较差异无统计学意义(F/P=0.173/0.894,0.241/0.812)。

2.1.4.2 属水平菌群丰度比较 在属水平上,与正常对照组比较,PCOS组小鼠中布劳特氏菌属(Blautia)、韦永氏球菌属(Veillonella)、孪生球菌属(Gemella)和梭形杆菌属(Fusobacterium)的丰度增加,颤螺旋菌属(Helicobacter)、粪球菌属(Coprococcus)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的丰度减少(P均<0.05);与PCOS组比较,BBR组普氏菌属(Prevotell)、韦永氏球菌属(Veillonella)、孪生球菌属(Gemella)和梭形杆菌属(Fusobacterium)的丰度降低,而布劳特氏菌属(Blautia)、颤螺旋菌属(Helicobacter)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、粪球菌属(Coprococcus)、副杆菌属(Parabacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、罗氏菌属(Roseburia)、酪酸菌属(Butyricicoccus)、链球菌属(strecoccus)和帕拉普氏菌属(Paraprevotella)等有益菌属的丰度均增加(P均<0.05)。前15位有丰度差异的属水平菌群见图2。

图2 4组小鼠属水平肠道菌群丰度比较

2.2 各组小鼠体质量比较 正常对照组、PCOS组、达英-35组和BBR组小鼠末次给药时体质量分别为(16.23±0.87) g、(22.76±3.23)g、(18.45±0.96)g和(17.88±0.43)g。与正常对照组小鼠比较,PCOS组小鼠体质量增加(t/P=4.782/0.013);与PCOS组比较,达英-35组和BBR组小鼠体质量明显降低(t/P=3.133/0.011,3.668/0.004)。

2.3 各组小鼠发情周期比较 小鼠月经周期呈现动情前期(P)、动情期(E)、动情间期(M)和动情后期(D),4～5 d为1个性周期且规律出现;阴道涂片细胞学分析发现,正常对照组小鼠月经周期正常,PCOS组小鼠D期延长,提示无排卵;达英-35组和BBR组小鼠发情周期在治疗后逐渐恢复规律,见图3。

注:P.动情前期;E.动情期;M.动情间期;D.动情后期。

2.4 各组小鼠血清性激素水平比较 与正常对照组比较,PCOS组小鼠血清T、LH和LH/FSH水平升高,E2和FSH水平降低(t/P=4.626/0.001,5.703/<0.001,2.578/0.028,2.847/0.017,3.079/0.012)。与PCOS组比较,达英-35组小鼠血清T、LH和LH/FSH水平降低,E2和FSH水平升高(t/P=3.416/0.007,4.596/0.001,2.327/0.042,2.389/0.038,3.354/0.007),BBR组血清T、LH和LH/FSH水平亦降低(t/P=4.602/0.001,6.101/<0.001,2.535/0.030),但PCOS组和BBR组E2和FSH水平比较差异无统计学意义(t/P=1.031/0.327,1.623/0.136),见表2。

表2 各组小鼠血清性激素水平比较

2.5 各组小鼠胰岛素代谢相关指标水平比较 与正常对照组比较,PCOS组小鼠FPG、FINS和HOMA-IR水平升高,ISI降低(t/P=4.156/0.002,3.255/0.009,7.439/<0.001,3.541/0.005);与PCOS组比较,BBR组FPG、FINS和HOMA-IR水平明显下调,ISI上调(t/P=5.950/<0.001,2.914/0.015,7.630/<0.001,3.198/0.010);达英-35组和PCOS组比较,FINS和HOMA-IR水平亦降低,ISI升高(t/P=2.908/0.016,6.096/<0.001,3.194/0.010),而FPG差异无统计学意义(t/P=0.906/0.386),见表3。

表3 各组小鼠胰岛素代谢水平比较

2.6 各组小鼠卵巢组织病理形态比较 HE染色结果显示,与正常对照组比较,PCOS组小鼠的卵巢形态发生了改变,卵巢皮质增厚,结构不均匀,无黄体或黄体数量极少,囊性卵泡体积增大,卵巢呈典型的多囊性改变,原始卵泡和初级卵泡数量明显减少。与PCOS组比较,达英-35组镜下可见卵巢皮质层略有变薄,黄体数量增多,卵泡体积变小;BBR组小鼠卵巢皮质层显著变薄,黄体数量明显增多,卵泡形态完整,排列整齐,见图4。

注:黑色箭头所示为卵泡,红色箭头所示为黄体。

2.7 各组小鼠结肠组织Claudin-1和Occludin表达水平比较 免疫组化结果显示,与正常对照组比较,PCOS组小鼠结肠组织Claudin-1和Occludin蛋白水平下降(t/P=3.806/0.003,3.795/0.004);与PCOS组比较,达英-35组和BBR组小鼠结肠组织Claudin-1和Occludin表达均升高(t/P=2.390/0.038,2.247/0.048;3.799/0.003,3.185/0.010),见表4。

表4 各组小鼠结肠组织Claudin-1、Occludin表达水平比较

2.8 各组小鼠卵巢组织PI3K/AKT相关蛋白表达比较 与正常对照组比较,PCOS组小鼠卵巢组织p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(t/P=13.474/<0.001,17.285/<0.001);与PCOS组比较,达英-35组和BBR组小鼠卵巢组织p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(t/P=7.323/<0.001,7.564/<0.001;7.473/<0.001,8.187/<0.001),见表5。

表5 各组小鼠结肠组织PI3K/AKT通路相关蛋白表达比较

3 讨 论

PCOS是育龄妇女常见的内分泌紊乱性疾病,患者面临排卵障碍引起的不孕症等疾病的更高风险[1]。目前西医治疗PCOS的药物长期使用效果不佳,甚至会产生诸多不良反应。开发既能有效治疗PCOS且不良反应小的药物,并探索其作用机制,已成为当今PCOS研究的重要方向和热点。

根据PCOS临床及病理特征,Kafali等[9]首创的利用非甾体类芳香化酶抑制剂来曲唑构建雌鼠PCOS模型,是目前公认的、较为全面的、能够反映PCOS临床患者内分泌状态和卵巢病理改变的良好动物模型,表现出无排卵、性激素紊乱、体质量增加和胰岛素抵抗(IR)等一系列代谢特征。高雄激素血症是PCOS的重要病理特征之一,T水平受P450芳香化酶的影响,较高雄激素可引起PCOS卵泡发育异常,卵泡壁无法破裂,导致卵泡闭锁和排卵障碍[10]。此外,高雄激素血症会诱导前卵泡堆积,FSH减少和功能下降。依赖FSH的P450芳香化酶合成受到抑制,卵巢T向E2的转化减慢,导致高T低E2。同时,高LH/FSH比率被认为是PCOS的诊断标志,提高FSH水平可促进卵泡生长[11]。因此,本研究利用来曲唑诱导PCOS小鼠模型,结果发现,PCOS小鼠表现出体质量逐渐下降,性激素代谢紊乱,卵巢呈典型的多囊性改变,提示模型构建成功。

BBR是中草药黄连、黄柏和小檗皮的主要活性成分,已被用于治疗腹泻、代谢紊乱和不孕症。最近证据表明BBR有望治疗PCOS,Mishra等[12]研究发现,BBR对临床症状、激素水平和血脂参数方面的调节作用比二甲双胍更有效,可有效降低PCOS患者的心血管疾病风险。动物实验研究亦显示,BBR可通过抑制炎性反应和细胞凋亡对PCOS大鼠发挥保护作用,促进PCOS大鼠排卵,改善其代谢紊乱和子宫内膜容受性[13]。本研究评估了BBR对PCOS小鼠生殖和代谢特征的影响,发现BBR不仅能显著缓解卵巢结构和功能障碍,还能通过调节血清性激素和胰岛素代谢发挥保护作用,这与以往的文献结果相一致[13],表明BBR可能在PCOS的治疗中发挥重要作用,但其调节血清激素水平和代谢异常的机制仍不清楚。

近年来大量研究表明,肠道菌群在人类多种疾病的发生、发展中发挥重要作用,提出了通过干预肠道菌群以防治疾病新的临床策略。由于PCOS患者高水平的循环胰岛素刺激卵巢细胞产生过量雄激素已得到体内和体外研究的支持,一种关于PCOS发展的微生物学假说认为,肠道菌群失调可促进卵巢产生雄激素,引发慢性炎性反应和IR干扰卵泡正常发育[14]。多个临床研究发现,与正常者比较,PCOS女性肠道菌群α多样性降低,而且PCOS高雄激素血症与肠道菌群α多样性呈负相关[15]。Li等[16]将PCOS小鼠粪便菌群移植到无菌小鼠中,发现肠道菌群与其宿主的性激素水平、发情周期和卵巢形态变化密切相关。因此,通过对肠道菌群的检测和靶向治疗,可能对PCOS的预测和疗效有一定的指导意义。本研究通过16S rDNA基因测序发现,PCOS小鼠肠道菌群发生了整体改变,且BBR治疗可显著改善PCOS小鼠肠道菌群α和β多样性。啮齿类动物和人类的肠道菌群门水平十分相似,均以厚壁菌门和拟杆菌门为主(约占80%)[17],与本结果类似。Torres等[18]发现,来曲唑诱导小鼠肠道菌群中多类菌属平均相对丰度发生显著变化,而BBR治疗可使这些菌属丰度降低。这些结果提示,PCOS小鼠存在肠道菌群失调,而BBR治疗可能通过调整小鼠肠道菌群组成和结构影响激素水平,从而改善PCOS。

肠道屏障功能受损往往是PCOS发病机制中一个重要的加重因素[19],上调肠黏膜中Claudin-1和Occludin的表达可减少肠黏膜损伤,为预防肠屏障功能障碍提供了新的方向。本研究发现,BBR干预后,结肠组织中Claudin-1和Occludin的表达明显增加,粪球菌属、颤螺旋菌属和罗氏菌属丰度上调。研究发现这些细菌可通过抑制TLR-NF-κB通路减轻炎性反应,有助于调节肠道平衡,维持肠道屏障功能,促进受损组织的修复和再生[20]。此外,补充BBR后,链球菌、布劳特氏菌和乳酸菌等产生短链脂肪酸(SCFA)的菌属有所增加,可为上皮细胞提供能量,增加紧密连接蛋白表达,促进有益菌生长[7]。研究表明,罗氏菌属和颤螺旋菌属可参与产生丁酸盐和丁酸盐样物质,以保护肠道屏障功能的完整性[21]。这些结果提示,BBR通过影响肠道菌群的组成或产生SCFA、丁酸盐和丁酸盐样物质来改善肠道屏障功能。

IR是PCOS的典型特征,其中经典的PI3K/AKT信号通路通过促进葡萄糖转运并抑制糖元合成来调节代谢。Alaaeldin等[22]通过建立IR体外模型证实,IR与PI3K/AKT信号通路有关,胰岛素受体激活后,诱导胰岛素受体底物(IRS)磷酸化,与PI3K蛋白结合,调节细胞的葡萄糖摄入量。与此结果一致, BBR治疗后,PCOS小鼠血清FPG、FINS和HOMA-IR水平显著下降,卵巢组织PI3K/AKT通路磷酸化明显增多。此外,PI3K/AKT在维持肠道屏障功能方面发挥着重要作用,如在缺氧时调节Occludin和Claudin-1的表达,以及刺激肠道干细胞在肠道中的扩增[23]。因此,经BBR干预后,Claudin-1和Occludin显著下调,PCOS的病理状态得到改善。

综上所述,BBR可能通过调节肠道菌群并激活PI3K/AKT信号通路,降低PCOS小鼠体质量和胰岛素抵抗,改善激素水平,减轻卵巢功能障碍,增强肠道通透性和肠道屏障功能。然而,BBR如何影响PCOS小鼠肠道菌群的确切机制还需要进一步研究。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨宇琦:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写;吴丽娜:提出研究方向,论文审核;孙克:实施研究过程,资料搜集整理;邢伟园:进行统计学分析;侯越:实施研究过程,数据收集、分析整理;张丽文:实施研究过程,论文修改