cGAS-STING通路调控NCOA4介导的铁自噬在HT22细胞缺氧复氧损伤中的作用

赵蓝,李镇文,钟振通,詹丽英,高文蔚

脑缺血再灌注损伤是指脑组织在恢复血流后损伤不但未能减轻反而会加速诱导细胞死亡的现象[1-3]。已有研究表明当原代神经元被给予缺氧1 h复氧6 h处理,模拟脑缺血再灌注损伤早期时,核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4, NCOA4)介导的铁自噬—死亡可加重细胞损伤[4]。前期实验亦表明再灌注早期cGAS-STING通路激活后NCOA4介导的铁自噬能导致神经损害[5]。另有研究发现干扰素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes, STING)具有与铁自噬蛋白NCOA4直接作用的结合位点,可促进游离铁的释放诱发铁死亡[6-7]。同时STING还可通过构象变化与自噬相关蛋白LC3作用介导细胞自噬并放大氧化应激损伤[8]。因此新近观点认为铁自噬—死亡是一个动态连续变化过程,其中氧化应激是诱导机体铁自噬—死亡的始动因素,而铁死亡则是一种自噬依赖的细胞死亡方式[9-11]。前期研究已证实再灌注早期铁自噬可加重脑损伤,本研究旨在探讨在复氧后期环鸟苷酸—腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)-STING(cGAS-STING)通路调控NCOA4介导的铁自噬在HT22细胞缺氧复氧损伤中的作用,报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)HT22细胞系:HT22细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司(CL-0697); (2) 试药试剂:NCOA4慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司;活性氧(ROS)检测试剂盒(编号:S0033S)、细胞计数法(CCK-8)试剂盒(编号:C0037)、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(编号:C0016)及丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(编号:S0131S)均购自碧云天生物技术有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(编号:A001)购自南京建成生物工程研究所;铁含量检测试剂盒(编号:MAK025)购自Sigma-Aldrich;(3)仪器设备:酶标仪(PerkinElmer, EnSight)、荧光倒置显微镜(OLYMPUS, IX71)、化学发光凝胶成像系统(BIO-RAD, ChemiDoc)。

1.2 实验方法 2020年9月—2022年12月于武汉大学人民医院中心实验室进行实验。细胞分组及处理:将HT22细胞系随机分为4组(n均=6),对照组(Ctrl组)、缺氧复氧组(HR组)、缺氧复氧+RU.521组(HR+RU组)、缺氧复氧+RU.521+NCOA4过表达组(HR+RU+NCOA4组)。除Ctrl组外其他3组均需在无糖缺氧条件下培养6 h再复糖复氧培养24 h构建缺氧复氧模型(对照组在常氧培养箱中使用含糖培养液,培养时间相同),HR+RU组及HR+RU+NCOA4组提前给予cGAS抑制剂RU.521(美国MCE公司)3.0 μmol/L处理24 h后构建缺氧复氧模型,HR+RU+NCOA4组于缺氧复氧前5 d给予NCOA4慢病毒转染(上海吉凯公司)。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 免疫荧光检测ROS:根据说明书要求配置DCFH-DA工作液(上海碧云天公司),提前1 d取各组处理后细胞接种于6孔板中,37℃培养箱中继续培养,观察细胞生长情况至其汇合度适宜后去除培养基,并用PBS缓冲液洗涤以减少培养基等物质对实验结果的干扰,吸除洗涤缓冲液后添加工作液,37℃培养箱内孵育30 min,随后吸去工作液,用 PBS 缓冲液洗涤 2～3 次,最后用 PBS 覆盖细胞,荧光倒置显微镜下观察并拍照。

1.3.2 ELISA法检测CCK8、LDH释放量、MDA、SOD 及亚铁离子含量:不同处理组细胞复糖复氧培养24 h后将细胞样品处理并收集裂解后的细胞上清液,根据实验需求准备并配制所需工作液,将细胞上清液与工作液混匀并孵育,反应充分后应用酶标仪于不同波长处检测样品吸光度,根据吸光度值计算样品中目标物质的浓度或含量,具体包括细胞活力CCK8、LDH释放量、MDA、SOD及亚铁离子含量。

1.3.3 Western blot检测cGAS-STING通路及铁自噬相关蛋白:不同处理组细胞复糖复氧培养24 h后胰酶消化取样提取蛋白,根据蛋白浓度确定适宜上样量随即进行电泳分离,应用电转仪将分离的蛋白转移到PVDF膜上,并使用封闭液进行处理。随后在4℃摇床上用一抗(各检测指标相应一抗的稀释比例为:cGAS(1∶500,武汉爱博泰克)、STING(1∶1 000,武汉三鹰)、NCOA4(1∶500,上海爱必信)、LC3B(1∶1 000,美国CST)、铁蛋白(1∶1 000,英国Abcam))孵育过夜, TBST洗涤掉未结合的抗体,并用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育60 min后再次用TBST洗涤,使用显影液显影并观察蛋白的表达水平。

2 结 果

2.1 各组HT22细胞氧化应激指标比较 与Ctrl组比较,HR组细胞中ROS、MDA升高,SOD降低(P<0.05);与HR组比较,HR+RU组ROS、MDA降低,SOD升高(P<0.05);与HR+RU组比较,HR+RU+NCOA4组ROS、MDA升高,SOD降低(P<0.05),见表1。

表1 各组HT22细胞氧化应激指标比较

2.2 各组细胞活力与LDH含量比较 与Ctrl组比较,HR组HT22细胞中CCK8降低,LDH增多(P<0.05);与HR组比较,HR+RU组CCK8升高、LDH降低(P<0.05);与HR+RU组比较,HR+RU+NCOA4组CCK8降低,LDH升高(P<0.05),见表2。

表2 4组HT22细胞活力与LDH含量比较

2.3 各组HT22细胞中铁自噬蛋白表达比较 与Ctrl组比较,HR组细胞中NCOA4、LC3B表达升高(P<0.05);与HR组比较,HR+RU组NCOA4、LC3B降低(P<0.05);与HR+RU组比较,HR+RU+NCOA4组NCOA4、LC3B表达升高(P<0.05),见表3。

表3 4组HT22细胞铁自噬蛋白的表达比较

2.4 各组HT22细胞中铁蛋白及亚铁离子的表达比较 与Ctrl组比较,HR组细胞铁蛋白、亚铁离子升高(P<0.05);与HR组比较,HR+RU组铁蛋白升高、亚铁离子降低(P<0.05);与HR+RU组,HR+RU+NCOA4组铁蛋白降低,亚铁离子升高(P>0.05),见表4。

表4 各组HT22细胞中铁蛋白及亚铁离子的表达比较

2.5 各组HT22细胞cGAS-STING通路的表达比较 与Ctrl组比较,HR组细胞中cGAS、STING表达升高(P<0.05);与HR组比较,HR+RU组cGAS、STING表达降低(P<0.05);与HR+RU组比较,HR+RU+NCOA4组cGAS、STING表达差异无统计学意义(P>0.05),见表5。

表5 各组HT22细胞cGAS-STING通路的表达变化

3 讨 论

在应激、压力等条件刺激下机体通过启动细胞程序性死亡以应对伤害,其中cGAS-STING为经典的通路,其研究主要集中在天然免疫方面,该通路的激活既能识别来自病毒、细菌等外源性的DNA,又能鉴别自身线粒体、肿瘤或死亡细胞的DNA,从而引起广大学者的关注[12-14]。新近发现cGAS-STING通路参与了DNA的损伤修复,并能调控NF-κB参与炎性反应,还可介导自噬溶酶体依赖的细胞死亡[15-18]。另有研究指出在巨噬细胞和外周血单核细胞中,活化的STING与NCOA4结合,启动了STING驱动的以铁蛋白为目标的细胞吞噬过程,这一级联过程会导致脂质过氧化,并最终引发铁死亡[19-20]。在本研究中,课题组全面探索了在氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)损伤背景下cGAS-STING通路激活、NCOA4介导的铁自噬,以及随之而来的对铁代谢、自噬过程和氧化应激反应的影响之间错综复杂的相互作用。

早期研究认为铁死亡在形态学、生物学和遗传学等方面均不同于凋亡、自噬和坏死[21]。但越来越多的证据表明选择性自噬有助于铁死亡的进展[22-23]。新近发现铁自噬具有调控铁死亡的作用,其可通过释放亚铁离子促进氧化应激导致ROS大量生成进而启动铁死亡;同时有研究指出铁死亡启动所需的ROS源于铁自噬产生的活性氧[24-25]。以上结果提示铁自噬—死亡是一个动态连续变化的过程,铁自噬是始动因素,而铁死亡则是结局指标。在神经退行性疾病中,NCOA4介导的铁自噬过度激活已被证实可以启动铁死亡进一步诱导不可逆的脑损伤[26-28]。此外,铁自噬作用的增强会增加神经元对缺血和缺氧的敏感性,破坏正常的脑代谢和功能,从而加剧再灌注损伤[29]。本研究同样表明HT22细胞缺氧复氧后cGAS-STING通路激活,进而NCOA4介导的铁自噬增多,同时氧化应激指标升高;而给予cGAS抑制剂后铁自噬降低,抗氧化应激指标升高,损伤减轻。这与以往研究相符,强调了cGAS-STING通路激活后启动铁自噬对脑缺血再灌注损伤的不利影响。

亚铁离子作为铁自噬通过自噬溶酶体降解释放出的物质,其可通过芬顿反应导致脂质过氧化进而引起损伤[30-31]。而NCOA4可通过铁自噬有效调控铁蛋白水平进而维持全身铁平衡,机体缺铁时NCOA4上升促进铁蛋白降解释放亚铁离子,但亚铁离子增多时NCOA4泛素化降解增多抑制亚铁离子释放[32-33]。但在病理、应激等条件下,铁蛋白的调控会有更多机制参与。本研究发现缺氧复氧后铁蛋白与亚铁离子升高,可能与机体自我保护机制启动有关,通过增加铁蛋白提高对亚铁离子的储存以减少亚铁离子对机体的损伤;抑制cGAS表达后铁蛋白进一步增加而此时亚铁离子显著下降,表明抑制cGAS-STING通路激活可增强机体的保护作用;但过表达NCOA4时由于其可促进铁蛋白降解进而呈现出下降趋势,同时大量亚铁离子释放导致损伤加重。

综上,在HT22细胞缺氧复氧后期cGAS-STING通路上调,进而氧化应激增强,铁自噬过度激活导致损伤加重。抑制cGAS-STING通路可减轻HT22细胞缺氧复氧损伤,该保护作用可被过表达的NCOA4逆转。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

赵蓝:实施研究过程,论文撰写;李镇文:数据获取,参与撰写;钟振通:统计学分析;詹丽英:论文审核;高文蔚:研究构思,课题设计