辣椒中多酚的提取工艺和抗氧化活性研究

熊岑 阮沛仪 郭晓刚 刘大千 曾丽娴

摘要：建立了辣椒中多酚提取的超声波辅助萃取法，并优化得到最优提取条件。探讨了不同辣椒中多酚提取物的体外抗氧化能力。结果表明，辣椒多酚最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶25 （g/mL）、超声温度50 ℃、超声时间30 min。在最优条件下，对10种辣椒进行了多酚提取，含量为1.428～3.661 mg/g，且辣椒的多酚含量随着成熟度的增加而增大。通过对其中5种差异较大的辣椒品种的抗氧化活性进行对比，结果表明簇生朝天椒（较辣）的自由基清除能力相对较强，当多酚含量为50 μg/mL时，对DPPH自由基的清除率可达85.05%，对羟基自由基的清除率可达74.53%。该研究可为辣椒的高附加值深加工开发提供技术依据和理论参考。

关键词：辣椒；多酚；超声辅助萃取；抗氧化活性

中图分类号：TS255.1      文献标志码：A     文章编号：1000-9973（2024）02-0089-06

Study on Extraction Process of Polyphenols from Chili and Their Antioxidant Activity

Abstract： An ultrasonic-assisted extraction method for the extraction of polyphenols from chili is established and the optimal extraction conditions are obtained through optimization. The in vitro antioxidant capacity of polyphenol extracts from different chili is investigated. The results show that the optimal extraction process conditions of polyphenols from chili are ethanol concentration of 60%， solid-liquid ratio of 1∶25 （g/mL）， ultrasonic temperature of 50 ℃ and ultrasonic time of 30 min. Under the optimal conditions， polyphenols are extracted from ten kinds of chili and the content ranges from 1.428 mg/g to 3.661 mg/g， and the polyphenol content of chili increases with the increase of maturity.Through the comparison of antioxidant activity of five varieties of chili with significant differences， the results show that Capsicum annuum var.fasciculatum （spicier） has a relatively strong scavenging capacity on free radicals.When polyphenol content is 50 μg/mL， the DPPH free radical scavenging rate and hydroxyl free radical scavenging rate can reach 85.05% and 74.53% respectively. This study could provide a technical basis and theoretical references for the high added-value deep processing and development of chili.

Key words： chili; polyphenol; ultrasonic-assisted extraction; antioxidant activity

植物次级代谢产物（secondary metabolites）是不直接涉及到植物正常生长发育的有机物，但是其与植物抵御病虫侵害、应对环境胁迫等密切相关[1]，主要包括黄酮类、生物碱、多酚、萜类等[2]。植物中的生物活性次级代谢产物在药物、保健品、农药、化妆品领域中应用广泛，如抗疟疾药物青蒿素[3]、镇痛药物吗啡[4]都是投入临床的植物次级代谢产物[5]。由于需求量较大，研究者们一直致力于扩大植物生物活性分子的产量。其中，化学全合成方法可模拟天然产物结构实现纯人工合成，但是此类方法耗时、复杂、成本高。化学半合成方法则能够以植物中产量较多的前体化合物为原料，合成生物活性更高的目标分子，相比化学全合成方法更环保、成本更低。Xie等[6]以天然黄酮橙皮素为原料，合成了一系列新的黄酮类化合物，并测试了其抗肿瘤和抗炎特性。Yang等[7]以銀杏等植物中提取的单黄酮为原料，合成药效更好的双黄酮和三黄酮化合物。因此，植物中生物活性次级代谢产物的提取工艺和效率研究是其在药品、保健品、食品等领域开发的重要基础。

辣椒是我国重要的蔬菜和调味品，加工产品多、产业链长，是重要的工业原料作物，常年种植面积1 000多万亩，近年来已成为中国种植面积最大的蔬菜，2020年辣椒年产量占世界辣椒总产量的近40%。目前，辣椒在消费市场中的角色仍然主要是调味品和蔬菜，以鲜食[8]、干制品[9]、加工酱类[10]等形式供应。但是，由于其品种丰富且品质各异[11]，其高生物活性化合物含量增加了人们对辣椒其他价值的兴趣，对其高附加值的发掘与应用已经逐步受到重视。

辣椒富含类黄酮和酚类化合物[12-13]，可作为天然的膳食抗氧化剂应用于食品加工领域[14]，延缓或防止脂肪类食物在贮藏过程中变质、果蔬类物质变色等。在人体健康方面，自由基活性氧的形成是目前公认的诱导疾病的机制之一（如动脉粥样硬化、慢性炎症和某些癌症等）[15]，植物多酚和黄酮类物质作为人体的天然抗氧化剂来源可预防和减缓此类疾病。如Oboh等[16]研究表明辣椒多酚对肝脏和大脑的脂质过氧化有抑制作用[17]。此外，辣椒多酚和其含有的辣椒素也具有抗菌效果。目前，辣椒多酚含量也是新鲜辣椒质量评价和分级[18]、品种选育与筛选、物候期对品质影响[19]、加工适应性[20-21]的重要依据。目前，辣椒中多酚物质的提取以及品种差异相关的研究报道较少。因此，本文建立了辣椒中多酚提取的超声辅助萃取法，并对比不同常栽辣椒品种的差异，为辣椒的高附加值深加工开发提供了技术依据和价值参考。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究采用的10批次多品种辣椒包括7种朝天椒、1种魔鬼椒、1种线椒、1种羊角椒，均来自辣椒培育基地茂名市茂蔬种业科技有限公司。每个辣椒品种均选取果形一致、大小均匀的无病虫害和机械损伤的新鲜果实，于-4 ℃冷冻保存。

1.2 试剂

无水乙醇、无水碳酸钠：天津市百世化工有限公司；福林酚试剂：扬州市正大化学试剂玻璃仪器有限公司；没食子酸、水杨酸、硫酸亚铁（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；过氧化氢（分析纯）：西陇科学股份有限公司；抗坏血酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；DPPH：阜阳曼林生物技术有限公司。

1.3 主要仪器与设备

超声辅助提取装置（SHZ-D Ⅲ型循环水式多用真空泵、DGG-9146A型低温恒温槽、超声BILON-2008型波信号发生器） 上海比朗仪器制造有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；WP-UP-Ⅱ-20型实验室专用纯水机 四川沃特尔水处理设备有限公司；分析天平 上海上天精密仪器有限公司；JX-2008型组织捣碎机 青岛圣吉仪器系统有限公司；DHG-9145A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；JP-031S型数控超声波振荡器 深圳市日康达创超声波有限公司；SL-1000A型电动粉碎机 浙江省永康市松青五金厂；UV1800型紫外可见分光光度计 上海奥析科学有限公司。

1.4 方法

1.4.1 辣椒果肉中多酚的提取

本实验提取工艺优化及验证均采用同批次朝天椒作为实验对象。

1.4.1.1 溶剂萃取法

将新鲜辣椒粉碎，使用分析天平准确称取5.00 g粉碎的辣椒于研钵中研碎，加入100.0 mL 60%的乙醇溶液并转移到250 mL烧杯中，在水浴温度为50 ℃下浸提20 min。浸取完毕后进行抽滤，测定所得滤液的吸光值。

1.4.1.2 超声波辅助法

准确称5.00 g粉碎的辣椒于研钵中研碎，按照1∶20的料液比加入60%乙醇溶液并转移到250 mL烧杯中，在50 ℃、200 W条件下进行超声辅助萃取20 min。提取完毕后进行抽濾处理，测定所得滤液的吸光值。

1.4.2 多酚得率的测定

提取辣椒中多酚含量的方法参照文献[22]中总多酚的测定方法，以没食子酸为标准品，配制一系列标准溶液，没食子酸中的酚羟基可还原福林酚试剂中的酒石酸铁，形成蓝色络合物，于765 nm处测定吸光值，绘制标准曲线（y=0.122 6x－0.026 6，R2=0.996 3，线性范围：0～6 μg/mL）。辣椒提取液经水稀释至适当的浓度后，准确吸取1.0 mL样品液于10.0 mL比色管中，平行3份，以蒸馏水为空白对照，于765 nm波长处测定吸光值，用回归方程计算样品总酚含量。

根据标准曲线得到样品提取液中总多酚的浓度，参照下式计算总多酚得率。

总多酚得率（%）=（C×V×F）/100×m。

式中：C为由标准曲线所得的样品液没食子酸含量（μg/mL）;V为提取液定容体积（mL）；F为稀释倍数；m为称取的辣椒质量（g）。

1.4.3 单因素实验

称取5.00 g粉碎的辣椒，以60%乙醇溶液为提取溶剂，在料液比1∶20 （g/mL）、超声功率200 W、提取温度50 ℃、提取时间20 min的条件下进行提取，分别考察乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL）、超声温度（30，40，50，60，70 ℃）、超声时间（10，20，30，40，50 min）对多酚提取得率的影响，抽滤后测定各样品的多酚得率，每个条件进行3次平行实验。

1.4.4 正交实验设计

在单因素实验的基础上，用L9（34）正交表设计实验，对乙醇浓度、料液比、超声温度和超声时间进行实验，考察其对多酚提取得率的影响，得出最佳提取条件。

1.4.5 抗氧化活性的测定

在最佳辣椒提取工艺条件下对辣椒中多酚进行提取，得到多酚粗提物，进行减压蒸发得到粗提物浸膏。将粗提物浸膏溶于适量的蒸馏水中，加入等体积的纯乙醇提取，去除沉淀中的多糖等杂质，石油醚脱脂后用乙酸乙酯提取，减压蒸发即可得到纯化浸膏。将减压蒸发得到的纯化浸膏用60%的乙醇溶解定容，用紫外分光光度法测定其辣椒中多酚含量，再配制不同多酚浓度的样品溶液。

1.4.6 DPPH·清除率的测定

测定方法参考文献[23]，根据提取物多酚含量配制一系列浓度的多酚溶液（10.00，20.00，30.00，40.00，50.00 μg/mL），并配制一系列相同浓度的抗坏血酸溶液。分别取不同浓度的辣椒多酚提取液各2.0 mL于25 mL比色管中，再依次加入0.20 mmol/L的 DPPH溶液2.0 mL，另取一支比色管加入2.0 mL的蒸馏水作为空白对照，摇匀，放置于阴暗处避光反应30 min。于517 nm处分别测定其吸光值，记为A1，空白组记为A0。按相同的步骤测定抗坏血酸溶液的DPPH自由基清除率。

DPPH·清除率（%）=（1－A1/A0）×100%。

1.4.7 羟基自由基（·OH）清除率的测定

测定方法参考文献[24]，利用水杨酸捕获Fenton反应产生的·OH，加入多酚提取液和VC等，分别考察其与水杨酸竞争清除·OH的能力。取不同浓度的辣椒多酚样品溶液2.0 mL于25.0 mL比色管中，分别依次加入2.0 mL 6.00 mmol/L的FeSO4和2.0 mL 6.00 mmol/L的过氧化氢，静置15 min后，向其中加入6.00 mmol/L的水杨酸，在避光条件下反应30 min。于510 nm处测定其吸光值，记为A2，空白组记为A0，用蒸馏水代替样品溶液进行反应。按相同的步骤测定抗坏血酸溶液的羟基自由基清除率。

·OH清除率（%）=（1－A2/A0）×100%。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

在相同条件下，分别考察了提取方式、乙醇溶剂体积分数、料液比、超声温度、超声时间对辣椒中多酚提取得率的影响。

2.1.1 提取方式对辣椒中多酚提取得率的影响

在溶剂、料液比、提取时间和温度相同的条件下，分别采用溶剂浸提法和超声波辅助提取法进行多酚的提取，结果见图1。

由图1可知，超声波辅助提取法提取辣椒多酚的效果优于溶剂浸提法。

2.1.2 乙醇浓度对辣椒中多酚提取得率的影响

由图2可知，在一定条件下，随着乙醇浓度的增大，样品中多酚的提取得率呈先迅速上升到最高峰再下降的趋势。当乙醇浓度为60%时，样品中总多酚的提取得率达到最大值。随着乙醇浓度的增加，其他醇溶性物质也增加，影响了多酚得率的进一步提高[25]。

2.1.3 料液比对辣椒中多酚提取得率的影响

由图3可知，多酚的提取得率随着料液比的增大而逐渐增加，这可能是因为随着溶剂量的增大，多酚与溶剂的接触面积变大，使得物质的扩散速度加快，更有利于样品中多酚的提取。但当料液比达到1∶30 （g/mL）之后，多酚提取得率变化相对平稳。为减少溶剂的浪费、节省提取成本，选取1∶30 （g/mL）为最佳的料液比。

2.1.4 超声温度对辣椒中多酚提取得率的影响

由图4可知，多酚的提取得率随着超声温度的升高呈现先上升后下降的趋势。当超声温度为60 ℃时，多酚提取得率达到峰值。但超声温度继续升高，引起了多酚的氧化或降解反应，导致多酚提取得率减少。

2.1.5 超声时间对辣椒中多酚提取得率的影响

由图5可知，当超声时间小于30 min时，多酚提取得率随着超声时间的增加而急速上升；当超声时间到30 min时，多酚提取得率达到峰值；当提取时间超过30 min时，多酚提取得率随着超声时间继续增加呈平缓下降的趋势。这可能是因为延长超声时间反而会使辣椒中的色素、辣椒碱等物质溶出，增加杂质，从而影响了多酚的溶出。因此，选择30 min作为多酚的最适超声时间。

2.2 正交实验结果与验证

2.2.1 正交实验结果分析

根据单因素实验结果，选取乙醇浓度60%、料液比1∶30 （g/mL）、超声温度60 ℃和超声时间30 min作为考察因素，进行正交实验，设计的正交实验各因素水平见表1，实验结果分析见表2。

由表2可知，KA1、KA2、KA3的大小不相等，说明A因素的水平变动对实验结果有影响，而由KA2＞KA1＞KA3，可以判定A2为A因素的优水平。同理，确定B1、C1、D2分别为B、C、D因素的优水平。4个因素的优水平组合A2B1C1D2为辣椒多酚提取的最佳方案，即乙醇浓度60%、料液比1∶25 （g/mL）、超声温度50 ℃、超声时间30 min。

根据极差Rj的大小，可以判断各因素对实验指标的影响大小。由表2可知本实验极差Rj的计算结果，即RA＞RC＞RD＞RB，所以各因素对辣椒多酚提取效果影响的次序为A＞C＞D＞B，即乙醇浓度＞超声温度＞超声时间＞料液比。由表2方差分析可知，各因素均对辣椒多酚的提取影响显著。

2.2.2 結果验证

在正交实验确定的最佳组合条件下进行提取，即以60%乙醇溶液为提取溶剂，在料液比1∶25 （g/mL）、超声功率200 W、超声温度50 ℃、提取时间30 min的条件下平行测定3次。结果表明，总多酚得率为21.86%，RSD值为2.15%，表明该工艺条件是合理可行的。

2.3 不同品种辣椒中多酚的体外抗氧化能力分析

自由基与机体的许多功能紊乱和疾病有着密切的关系。辣椒中多酚的抗氧化能力可以清除人体内过量的自由基，对改善人体健康有积极的作用。因此，探讨辣椒对自由基的清除作用具有重要的意义。本实验选取5种辣椒样品进行体外抗氧化性的研究，包括7种朝天椒中多酚含量较高的单生朝天椒（香辣）簇生朝天椒（较辣）以及魔鬼椒、线椒、羊角椒。

2.3.1 DPPH·清除能力

5种辣椒中多酚DPPH自由基清除实验结果见图6。

由图6可知，5种辣椒多酚提取液均具有明显的清除DPPH自由基的能力，清除能力大部分接近同浓度的抗坏血酸（VC）。随着样品多酚提取液浓度的增大，辣椒中多酚和抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力均逐渐增强。在浓度为10～30 μg/mL时，5种辣椒与抗坏血酸对DPPH自由基的清除能力基本呈线性增长；在浓度大于30 μg/mL之后，簇生朝天椒（较辣）、单生朝天椒（香辣）和线椒与抗坏血酸的清除率增速逐渐变得缓慢。此时，簇生朝天椒（较辣）与单生朝天椒（香辣）的清除能力相近，这可能是因为它们同属朝天椒；而魔鬼椒和羊角椒在浓度达40 μg/mL之后才出现平缓趋势。5种辣椒的多酚对DPPH自由基的清除能力由小到大为魔鬼椒<羊角椒<线椒<单生朝天椒（香辣）<簇生朝天椒（较辣），后三者均强于抗坏血酸溶液。辣椒多酚含量为50 μg/mL时，清除能力最强的簇生朝天椒（较辣）对DPPH自由基的清除率最大，达到85.05%。

2.3.2 羟基自由基（·OH）清除能力

5种辣椒中多酚的·OH清除实验结果见图7。

由图7可知，5种辣椒的多酚提取物均具有很好的·OH清除能力，随着多酚提取物浓度的增大，其对羟基自由基的清除能力呈上升趋势，并表现出量效关系。在相同浓度下，5种辣椒多酚提取物的羟基自由基清除能力接近，且均明显高于抗坏血酸溶液。其中，簇生朝天椒（较辣）的清除能力相对较强，辣椒多酚含量为50 μg/mL时，·OH清除率最大，达到74.53%。

2.4 辣椒品种和成熟度对提取多酚含量的影响

对比了10种不同品种辣椒中的多酚含量，见图8。

由图8可知，不同辣椒中的多酚物质含量存在显著差异。青辣椒中多酚含量最高的是No.19单生朝天椒（3.286 mg/g），含量最低的是线椒（1.428 mg/g）；红辣椒中多酚含量最高的是单生朝天椒（果皮硬度高，3.661 mg/g），含量最低的是羊角椒（2.035 mg/g）。10种辣椒中多酚物质含量范围为1.428～3.661 mg/g。辣椒的多酚含量因成熟度的不同而存在差异，辣椒的多酚含量随成熟度的增大而增加。该结论与Ornelas-Paz等[26]的研究结果一致，在同一品种辣椒中，成熟度高的红辣椒的多酚比成熟度相对低的青辣椒稍高，但差异不大。Navarro等[27]研究发现，不同成熟期辣椒果实中多酚含量的变化一致，青辣椒（5.47 mg/g）的总多酚含量比红辣椒（5.25 mg/g）略高。

3 结论

本文在单因素实验的基础上，使用正交实验优化，获得的超声辅助萃取法最佳的辣椒多酚提取工艺是乙醇浓度60%、料液比1∶25 （g/mL）、超声温度50 ℃、超声时间30 min。在最佳提取工艺条件下，对5种辣椒中多酚的抗氧化活性进行了测试，对DPPH自由基的清除能力由小到大为魔鬼椒<羊角椒<线椒<单生朝天椒（香辣）<簇生朝天椒（较辣），后三者均强于抗坏血酸溶液。5种辣椒的多酚提取物均具有很好的·OH清除能力，均明显高于抗坏血酸溶液且清除能力接近，簇生朝天椒（较辣）的清除能力相对较强。辣椒多酚浓度为50 μg/mL时，清除能力最强的簇生朝天椒（较辣）对DPPH自由基的清除率最大，达到85.05%，·OH清除率最大，达到74.53%。辣椒品种和成熟度会影响提取多酚的含量，在最佳工艺条件下，10种辣椒的多酚含量范围在1.428～3.661 mg/g，辣椒的多酚含量随成熟度的增大而增加，在同一品种辣椒中，成熟度高的红辣椒的多酚比成熟度相对低的青辣椒稍高。本研究可为辣椒品质和加工适应性评价以及高附加值深加工开发提供技术依据和理论参考。

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