液相色谱-串联质谱法测定大米中3种香兰素的含量

周美丽，王瑞，卢薇，王岩

宝鸡市食品药品检验检测中心（宝鸡 721000）

香兰素类增香剂作为一类广谱型香料，在食品、饮料、化妆品、日用化学品及医药等领域使用非常广泛，其不仅可用作定香调香剂、协调剂及矫味剂，还能给产品增添浓郁的香草味和奶香味，食品中常用的有香兰素及其甲基、乙基合成物[1-2]。香兰素是人类合成最早的香精之一，产量亦居全球首位[3]。香兰素与硫酸二甲酯在碱性环境中反应生成的甲基香兰素香气浓郁持久，而乙基香兰素的香气则是香兰素的3～4倍。香兰素类化合物是公认的较安全的食品添加剂，低剂量使用可发挥多重作用且呈现出有益健康的特性，高剂量的摄入则会导致人产生头晕、恶心、呕吐等不适，甚至会损坏人体肝、肾等器官[3]。

GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中对食品中可使用的香精种类、使用范围及使用注意事项进行明确规定，这类增香物质不允许在大米中使用。基于我国香米生产现状，大部分仍依赖进口，且成本较高，一些不法企业为迎合消费者通过将普通大米添加香精伪装成泰国香米等，骗取消费者而不当得利，这件事情在“3·15”晚会也遭到曝光而公之于众。关于这3种香料的检测方法有分光光度法、电化学法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱法等[4-5]。试验选择液相色谱法和液相色谱-质谱/质谱法2种方法对于大米中3种香精成分进行测定，结果发现液相色谱法因选择性差，不能很好将甲基香兰素、乙基香兰素进行有效分离，容易造成色谱峰的重合，无法准确定性。因此，选择高效液相色谱-串联质谱法检测3种物质，以期建立快速高效便捷和准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

1260 Infinity ⅡLC/TQ型液质联用仪（美国Agilent公司）；KQ-500 DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；IKA VORTEX GENIUS3型涡旋混合器（德国IKA公司）；UPH-IV-20TN型超纯水机（四川优普）；SQP Practum612-1CN型电子天平（感量0.000 1 g）和CPA225D电子天平（感量0.000 01 g），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 材料与试剂

香兰素（批号22030581，纯度99.90%），甲基香兰素（批号22030716，纯度99.40%），乙基香兰素（批号220300404，纯度99.90%），均购自坛墨质检标准物质中心；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷、乙酸乙酯等（色谱纯，均购自德国Sigma公司）；分离用色谱柱（XDB C18，规格50 mm×4.6 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技公司）；0.22 μm有机滤膜（天津津腾）；实验室用超纯水（优普制水机制备）；试验样品为2022—2023年食品抽检大米样品。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制

精密称取100 mg香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素至检定合格的100 mL容量瓶中，用甲醇充分溶解并定容，得到的标准储备溶液浓度为1.00 mg/mL；吸取上述溶液各1.0 mL混合到100 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，得到浓度10 μg/mL混合标准储备溶液；用空白基质溶液配制浓度为5，10，20，50，80和160 ng/mL混合标准系列工作溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

称取1 g粉碎并混合均匀的试样，置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈-水（9∶1，V/V），置于涡旋混合器上振荡30 s，将离心管进行25 min超声处理，以10 000 r/min离心5 min后，将上层清液通过0.22 μm滤膜过滤至液相小瓶中，待测。同时，除不加样品外，同法处理，做空白试验进行比对。

1.3.3 高效液相色谱-串联质谱检测条件的建立

液相色谱条件：XDB C18色谱柱（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL/min；色谱柱温度30 ℃；进样体积5 μL；流动相梯度洗脱程序见表1。质谱条件：采用ESI（+）电喷雾离子源；MRM多反应监测采集数据；雾化气15 psi；雾化气温度300 ℃；雾化气流量7.0 L/min；Sheath Gas 温度250 ℃；Sheath Gas流速11.0 L/min。

表1 梯度洗脱条件

2 结果与分析

2.1 分析条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

将1 μL 1 μg/mL的目标化合物，分别泵入质谱仪进行一级质谱扫描确定母离子质量数。以3种香精成分的母离子质量数进行选择离子扫描，通过调节碰撞能量，选择2个响应较高的碎片离子作为子离子，进一步在MRM模式下去优化检测参数，优化后的定性离子、定量离子、去簇电压和碰撞能量见表2，3种香精成分定量离子的MRM图见图1，特征离子扫描质谱图见图2。

图1 香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素定量离子的MRM图

图2 香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素特征离子扫描质谱图

表2 MRM参数

2.1.2 液相条件的优化

试验对比不同浓度甲酸水溶液-乙腈流动相体系下3种化合物的梯度洗脱效果。结果表明，在相同的梯度洗脱条件下，随着0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%甲酸浓度比例的加大，3种化合物的响应值随之增高，峰型也进一步变好。进一步比较将乙腈换做甲醇后的洗脱效果，发现在0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱的体系下，3种香精成分的响应值进一步提高，说明离子化效率更好，检测灵敏度改善明显。因此，以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相进行洗脱。

2.2 样品提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

从大米中有效提取出目标化合物是准确测定含量的前提。试验通过对阳性样本的测定，进一步研究比较正己烷、乙腈、乙酸乙酯对3种香精成分的提取效果。测定结果显示，正己烷提取效果不达标，说明未完全提取出来。而乙酸乙酯和乙腈的提取效果基本满足要求，但因提取过程水的加入能提高香兰素的提取效率，而乙酸乙酯与水不互溶，因此乙腈是比较理想的提取试剂。进一步研究不同体积水浸润后大米中3种香精成分用乙腈提取的效果，结果发现不同体积的水对于提取效果影响不大，但显著影响出峰时间。当选择加入10 mL乙腈-水（9∶1，V/V）提取样品时，3种化合物的保留时间与对照品基本一致。

2.2.2 提取时间的选择

考察以乙腈-水（9∶1，V/V）为提取溶剂，3种化合物在不同超声处理时长下的提取效率。检测结果显示，随着样品在超声波里面提取时间的延长，3种香精成分的提取效率呈逐渐增加趋势，超声处理20 min后提取效率变化不大，25 min后基本稳定。因此，确定超声时间为25 min，以保证目标物质得到充分的提取。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性范围

配制5～200 ng/mL的系列标准混合溶液，按照1.3.3的仪器条件及优化过的检测方法进行分析，以目标组分的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标建立标准曲线。香兰素的线性方程为f(x)=77.466 090x-0.421 042，相关系数R2=0.999 0；甲基香兰素的线性方程为f(x)=128.379 021x-97.084 251，相关系数R2=0.999 5；乙基香兰素的线性方程为f(x)=147.775 496x-175.943 208，相关系数R2=0.999 4；结果表明，3种香精成分在5～200 ng/mL线性范围内相关系数良好。

2.3.2 检出限与定量限

称取11份1 g空白基质样品，加入一定浓度的混合标准溶液，加乙腈-水（9∶1，V/V）提取10 mL后测定，检出限为信噪比rSN≥3时的浓度，定量限为rSN≥10时的浓度。计算得香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的检出限分别为5，2和3 μg/kg，定量限分别为15，6和9 μg/kg，均低于BJS 201705《食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素的测定》规定的检出限和定量限。

2.3.3 回收率及精密度

回收率考察及精密度试验通过向空白基质样品中添加目标组分进行测定，加标水平选择BJS 201705给定的检出限、定量限及10倍检出限，每个加标水平重复测定6次，加标回收试验结果及精密度见表3。

2.4 样品测定

GB 2760—2014中规定大米中不得添加香精成分香兰素，BJS 201705方法中规定的3种香兰素的检出限为30 μg/kg，定量限为100 μg/kg。采用试验优化过的方法对抽检25个品种的大米样品中的3种香精成分进行测定。结果显示：25个样品均有香兰素成分的检出，含量范围为75.38～270.67 μg/kg，均高于检出限；甲基香兰素含量范围为5.00～27.412 μg/kg，均低于检出限；乙基香兰素只有4个样本有峰，含量范围在16.10～22.17 μg/kg之间，均低于检出限，其余样本没有出峰。试验检测的25批大米中全部检出香兰素，其中检出值大于100 μg/kg的样本占76%，由于样品是随机购入，且分别来源于甘肃、黑龙江、陕西、江苏、广西以及巴基斯坦、泰国等多个产地，同时非法添加的可能性不大。因此，考虑内源性可能性更大。有研究表明，米糠中含有大量香兰素及其前体物质阿魏酸，阿魏酸的C—C双键结构在氧化后即可成为香兰素或通过生物转化形成香兰素[6-7]。

3 讨论与结论

试验建立一种液相色谱-质谱/质谱法检测大米中香兰素类香精成分（包括香兰素、甲基香兰素和乙基香兰素）含量的方法。该方法快捷高效、灵敏度非常高、重复性良好，能有效满足大米中3种香精成分的快速测定。样品测定结果显示大米中内源性香兰素的存在，建议相关部门及时调整相应的国家标准限量值及监管措施，以免误判。