基于HPLC指纹图谱的葶苈大枣泻肺汤相关评价△

马云，关永霞，王艳，严琴琴，周冰，申凤霞，李倩，聂宗恒，范建伟*，赵利枝*

1.鲁南制药集团股份有限公司 经方与现代中药融合创新全国重点实验室，山东 临沂 276006；2.鲁南厚普制药有限公司 中药制药共性技术山东省工程研究中心，山东 临沂 276006；3.临沂大学，山东 临沂 276000

葶苈大枣泻肺汤源自张仲景所著的《金匮要略》[1]，由葶苈子、大枣2 味中药组成。方中葶苈子为主药，行泻肺逐水、化痰平喘之功效[2]；大枣予以佐之，和中扶正、缓和药力，乃泻肺而不伤脾之法[3]。葶苈大枣泻肺汤主治痰涎壅盛、咳喘胸满不得卧、心悸、苔腻、脉弦滑等[4]。目前，葶苈大枣泻肺汤的相关研究更多集中在临床应用上，其有较高的临床应用价值。例如，葶苈大枣泻肺汤及其加减方剂可有效改善患者心力衰竭问题，提高患者生存质量[5]；葶苈大枣泻肺汤加味治疗支气管哮喘，显著改善了患者肺功能水平与日间、夜间哮喘症状，在肺癌、心肌纤维化治疗中具有独特的效果[6-8]。目前未见葶苈大枣泻肺汤相关质量标准研究。葶苈大枣泻肺汤是中药复方制剂，化学成分复杂，开展其相关质量标准研究对经典方剂的临床推广与合理用药具有重要意义[9]。指纹图谱技术的应用和推广可实现对中药制剂物质基础、化学成分的整体性和复杂性的客观评价[10]。本研究对葶苈大枣泻肺汤的高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱进行研究，明确葶苈大枣泻肺汤中的指标成分，可为其质量标准的确立提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（Agilent 公司）；XS204/XSR204A 型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）；KS-5200DE型数控超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）；Medifuge型高速离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；Milli-Q 型超纯水仪（默克公司）。

1.2 试药

对照品槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷（特性量值以94.5% 计，批号：111854-201905）、芦丁（特性量值以≥90.5%计，批号：0080-9705）、异槲皮苷（特性量值以98.62%计，批号：100083-201907）、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷（特性量值以99.63%计，批号：110862-201703）、槲皮素（特性量值以99.1%计，批号：100081-201610）、异鼠李素（特性量值以99.9%计，批号：110860-201611）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯；异丙醇、磷酸、甲醇均为分析纯。

葶苈子、大枣饮片均由鲁南厚普制药有限公司提供，经经方与现代中药融合创新全国重点实验室高级研究员范建伟鉴定符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版（一部）[11]中葶苈子、大枣标准，葶苈子为十字花科植物播娘嵩Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl.（南葶苈子）的干燥成熟种子，产地为山东菏泽，购自临沂柯屹药业有限公司（批号分别为220302、220307、220311、220401、220405、220406、220412、220501、220604、220701、220915、220916、220921、220922）；大枣为鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实，产地为山西运城，购自安徽人民中药饮片有限公司（批号分别为220501、220502、220505、220508、220601、220602、220606、220702、220703、220901、220902、220903、220904、220905）。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液制备 取葶苈子90 g、大枣100 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密量取纯净水1900 mL并加入上述圆底烧瓶，加热回流1.5 h，滤过，滤液加水定容至1900 mL，混合均匀，取回流提取液适量，4000 r·min–1离心5 min（离心半径为5 cm），滤过（0.22 μm），续滤液即为葶苈大枣泻肺汤供试品溶液（共14批，编号为S1～S14）。

2.1.2 对照品溶液制备 取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-Oβ-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素适量，精密称定，分别用甲醇溶解，制成质量浓度分别为0.883 8、0.741 4、0.773 2、0.416 5、1.065 1、0.197 0 mg·mL–1的溶液，作为对照品储备液。精密量取上述对照品储备液，稀释成质量浓度分别为0.117 800、0.009 885、20.610 000、11.110 000、2.840 000、3.752 000 mg·mL–1的溶液，即为混合对照品溶液。

2.2 色谱条件

Agilent ZORBAX SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～5 min，95%～91%B；5～15 min，91%～89%B；15～37 min，89%～80%B；37～47 min，80%～70%B；47～53 min，70%～60%B；53～57 min，60%～95%B；57～65 min，95%B）；溶剂为甲醇；柱温为30 ℃；进样量为5 μL；检测波长为254 nm。理论板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷计不得低于5000，分离度>1.5。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素的保留时间分别为13.235、34.272、35.860、41.976、50.990、56.213 min。葶苈大枣泻肺汤HPLC图见图1。

图1 葶苈大枣泻肺汤HPLC图

2.3 方法学考察

参照《中国药典》2020 年版（四部）“分析方法验证指导原则（9101）”[12]，取2.1项下的混合对照品溶液及供试品溶液，按2.2 项下色谱条件分别进行精密度、稳定性、重复性试验。

2.3.1 精密度试验 取葶苈大枣泻肺汤（S1）供试品溶液，按2.2 项下色谱条件连续进样6 次，记录HPLC 图，以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。各共有峰相对保留时间的RSD为0.53%～0.77%，相对峰面积的RSD 为1.29%～1.56%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取葶苈大枣泻肺汤（S1）供试品溶液，按2.2 项下色谱条件于0、2、4、6、8、12、24、48 h 分别进样，记录HPLC 图。以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。各共有峰相对保留时间的RSD为0.29%～0.58%，相对峰面积的RSD 为1.33%～3.04%，均小于5.0%，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 按2.1 项下方法，取6 份供试品溶液（S1），按2.2 项下色谱条件将6 份供试品溶液分别进样，记录HPLC 图。以槲皮素-3-Oβ-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。各共有峰相对保留时间的RSD为0.31%～0.62%，相对峰面积的RSD 为1.41%～3.87%，均小于5.0%，表明该方法重复性良好。

2.4 指纹图谱建立及相似度评价

按2.1 项下方法取不同批葶苈子、大枣，制备供试品溶液。按2.2 项下色谱条件分别进样，记录HPLC 图；将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012A 版），以多点校正法进行图谱匹配，即得葶苈大枣泻肺汤指纹图谱。

2.5 特征峰含量测定

参照《中国药典》2020 年版（四部）“分析方法验证指导原则（9101）”[12]，取2.1项下对照品溶液、供试品溶液，按2.2 项下色谱条件分别进行线性关系考察，精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验。

2.5.1 精密度试验 分别取混合对照品溶液，按2.2 项下色谱方法连续进样6 次，记录HPLC 图，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素平均峰面积RSD 分别为0.33%、0.74%、0.42%、0.68%、1.98%、1.30%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验 取葶苈大枣泻肺汤（S1）供试品溶液，按2.1 项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、12、24、48 h 分别按2.2 项下色谱条件进样，记录HPLC图，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素平均峰面积的RSD 分别为 0.32%、0.70%、1.41%、1.87%、1.19%、2.08%，均小于3.0%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.5.3 重复性试验 取同一批葶苈子、大枣，按2.1 项下方法平行制备6 批供试品溶液，按2.1 项下方法制备供试品溶液，按2.2 项下色谱条件分别进样，记录HPLC 图，各成分含量的RSD 分别为0.65%、0.99%、1.80%、1.22%、2.96%、1.55%，均小于3.0%，表明方法重复性良好。

2.5.4 加样回收率试验 取葶苈大枣泻肺汤（S1）供试品溶液6 份，每份2 mL，分别准确加入含有等量各成分对照品的对照品储备液2 mL，按2.1 项下方法制备样品溶液，按2.2 项下色谱条件进样，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素加样回收率分别为97.44%、98.09%、97.85%、100.40%、95.95%、96.88%，RSD 分别为 2.14%、2.67%、1.69%、2.33%、3.11%、2.64%；各组分的平均回收率为95%～102%，且平均回收率的RSD 均小于4.0%，表明方法准确度良好。

2.5.5 线性关系考察 以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），回归方程见表1。槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素6 个成分在各自质量浓度范围内呈良好的线性关系。

表1 葶苈大枣泻肺汤中6个特征成分线性关系 μg·mL–1

取2.1 项下葶苈大枣泻肺汤供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行含量测定，并记录HPLC 图，计算成分含量。

3 结果与讨论

3.1 葶苈大枣泻肺汤指纹图谱

葶苈大枣泻肺汤指纹图谱共标定共有峰27 个，其中特征峰6 个（5 号峰、18 号峰、19 号峰、21 号峰、24 号峰、27 号峰）。经分析，14 批葶苈大枣泻肺汤图谱相似度均大于0.9，相似度良好，表明所建立的葶苈大枣泻肺汤指纹图谱质量稳定，可准确标记葶苈大枣泻肺汤的化学成分分布指纹特征（图2）。

图2 葶苈大枣泻肺汤特征指纹图谱

3.2 特征峰含量测定结果

不同批次供试品之间的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素的含量测定结果接近且均一，进一步说明本方煎煮过程稳定，不易受环境因素影响（表2）。

表2 葶苈大枣泻肺汤中6个特征成分质量浓度 μg·mL–1

3.3 质量控制指标成分选择

中药制剂化学成分相对复杂，药效的发挥并非由单一化学成分决定，而是不同药物之间配伍，协同作用，是多成分复合的结果。本研究参照《中国药典》2020 年版，结合相关文献报道[13-14]，选取葶苈子和大枣中具有代表性且与药效相关性强的成分作为指标成分。葶苈子主要含有硫苷类、异硫氰酸和芥苷类、黄酮类、强心苷类等成分[15]，其行泻下功能的主要为黄酮类成分。其中，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷为《中国药典》2020 年版葶苈子指标成分，具有祛痰、止咳、平喘的作用，兼具舒张支气管平滑肌、促进气管纤毛运动等多种药理作用[16]；异槲皮苷是槲皮素的氧苷衍生素，两者均具有平喘、降血压、调血脂的功效[13]，异鼠李素和异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷均具有止咳祛痰、消食化滞、活血散瘀的功效[17]。大枣中的芦丁属于维生素类成分，有保护毛细血管、防治高血压的功效[18]。本研究指认了葶苈大枣泻肺汤中皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龙胆双糖苷、芦丁、异槲皮苷、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖、槲皮素、异鼠李素6个成分，6个成分药理功效与葶苈大枣泻肺汤泻肺逐水、化痰平喘基本相符，能反映葶苈大枣汤的药效物质基础。中药制剂的开发关键在于建立从药材到饮片、中间体、制剂全链条的质量控制体系，严格把控制备过程中的质量情况、指纹图谱及多指标成分含量测定是评价中药制剂质量的重要手段[19-20]。

4 结论

本研究建立的葶苈大枣泻肺汤物质基准HPLC指纹图谱和多指标成分含量测定方法可较全面地反映其化学成分信息，且检测方法稳定可靠、简便可行、重复性好，可为葶苈大枣泻肺汤物质基准完善、制剂的质量控制标准研究提供数据支持。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。