海拔对大别山区野生宽叶山蒿叶片性状和品质的影响△

吴婷，李双鸽，李慧，赵亚臣，黄显章，刘大会*

1.湖北中医药大学 时珍实验室，湖北 武汉 430065；2.江西中医药健康产业研究院，江西 南昌 330000；3.江西中医药大学 院士工作站，江西 南昌 330000；4.南阳理工学院 河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，河南 南阳 473004

宽叶山蒿Artemisia stolonifera(Maxim.) Komar.为菊科蒿属真艾系植物，《中国植物志》记载其多生于低海拔湿润地区的林缘、疏林下、路旁、荒地与沟谷等处[1]。大别山区蕲春、英山、罗田、霍山、岳西等县的中、高海拔区域均有野生宽叶山蒿资源分布。本课题组前期经过系统的本草考证发现，宋代《本草图经》和明代《本草蒙筌》所记载的“九牛草”基原应为大别山区分布的宽叶山蒿[2]；对宽叶山蒿、艾叶叶片的显微结构和黄酮、酚酸类成分进行比较发现，宽叶山蒿与“四大艾”（“蕲艾”“祁艾”“北艾”“海艾”）各部位表皮毛特征、黄酮及酚酸类成分含量均存在差异[3-4]。生态环境是药用植物生长发育和品质好坏的决定性因素之一，海拔差异能够影响温度、降水量、光照强度等，这些环境因子会对药用植物生长和有效成分积累产生一定影响[5-9]。本课题组全面调查了湖北、安徽交界大别山区的宽叶山蒿野生资源分布情况，对不同海拔分布的宽叶山蒿野生居群进行采样，分析海拔对野生宽叶山蒿的叶片性状、出绒率、叶绒燃烧热解质量和叶片成分的影响，以期为宽叶山蒿资源开发利用提供参考。

1 材料

1.1 样品

2021 年6 月20 日采集湖北、安徽交界大别山区天堂寨地区不同海拔野生宽叶山蒿样品，所有样品经湖北中医药大学刘大会教授鉴定为菊科蒿属宽叶山蒿Artemisia stolonifera(Maxim.) Komar.，样品信息见表1。

表1 宽叶山蒿样品信息

1.2 仪器

TRACE 1310 型气相色谱质谱联用仪（美国Thermo Fisher 公司）；1260 型超高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；TGA/DSC3+型热重分析仪（瑞士梅特勒-托利多公司）；QE-100 型高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）。

1.3 试药

对照品新绿原酸（纯度≥98%，批号：906-33-2）、绿原酸（纯度≥98%，批号：327-97-9）、隐绿原酸（纯度≥98%，批号：905-99-7）购于成都德思特生物技术有限公司；对照品异绿原酸C（纯度≥98%，批号：32451-88-0）、异绿原酸A（纯度≥98%，批号：2450-53-5）、异绿原酸B（纯度≥98%，批号：14534-61-3）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；对照品异夏佛塔苷（纯度≥98%，批号：52012-29-0）购于武汉天植生物技术有限公司；甲醇、甲酸、乙腈、环己烷为色谱纯（德国Merck 公司）；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1 性状测定

在7 个海拔采样点各选取18 株生长正常、无病虫害的成熟植株，随机分为3 组，采用直尺测量每株宽叶山蒿的中部叶片长（叶基部至叶尖的长度）和叶片宽（叶片最宽处的长度）。

2.2 出绒率测定

采用四分法从每份样品中取干叶片10 g，置于高速万能粉碎机中，28 000 r·min–1粉碎30 s，将粉碎后的样品于一号筛中筛净粉末后得绒，采用公式（1）计算出绒率。

2.3 绒燃烧热质量特性测定

采用热重分析仪，程序升温扫描，设定实验温度为28～900 ℃；载气为氧气；升温速率为10 ℃·min–1；氧气体积流量为100 mL·min–1；Al2O3空坩埚为对照；样品用量5.7 mg。样本平行测定2份。宽叶山蒿叶绒的热重/差示扫描热量（TGA/DSC）曲线见图1。

图1 宽叶山蒿叶绒的TGA/DSC曲线

燃烧热解质量参数包括：平均速率（RV）、最大燃烧速率（RP）、着火温度（Ti）、燃尽温度（Tb）、燃尽时间（tb）、峰值时间（tp）、半衰期（ΔT1/2）、综合燃烧指数（S）、着火指数（Di）、燃尽指数（Db）和热量积分值（J）等。按公式（2）～公式（4）计算S、Di和Db。

2.4 挥发性成分测定

采用顶空固相微萃取结合气象色谱-质谱法（HS-SPME-GC-MS）分析宽叶山蒿挥发性成分，所得离子流图通过与Mainlib质谱数据库中的图谱进行比对，采用峰面积归一化法计算各成分的相对含量。宽叶山蒿样品色谱图见图2。

图2 宽叶山蒿叶片挥发性成分GC-MS图

图3 混合对照品和宽叶山蒿样品溶液的UPLC图

2.5 黄酮和酚酸类成分含量测定

采用超高效液相色谱法（UPLC），参考文献[4]方法测定样品中绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、异夏佛塔苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量。

2.5.1 色谱条件 采用ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.8%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～0.3 min，2%～5%B；0.3～1.0 min，5%B；1.0～7.0 min，5%～20%B；7.0～9.0 min，20%B；9.0～9.5 min，20%～25%B；9.5～12.5 min，25%～28%B；12.5～18.0 min，28%～40%B；18.0～18.3 min，40%～80%B；18.3～21.0 min，80%～98%B；21.0～24.0 min，98%B）；流速为0.5 mL·min–1；柱温为40 ℃；检测波长为330 nm；进样量为1 μL。

2.5.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品适量，分别用80%甲醇配制成新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异夏佛塔苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C 质量浓度为2.425、2.495、2.190、0.880、2.925、2.525、2.295 mg·mL–1的单一对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备 精密称取宽叶山蒿叶片粉末（过六号筛）1 g于50 mL锥形瓶中，加入80%甲醇20 mL，称定质量，放置过夜，超声处理30 min，冷却至室温后用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.5.4 线性关系考察 精密量取单一对照品溶液，用80%甲醇逐级稀释，0.22 μm 微孔滤膜滤过，进样。以各成分质量浓度为横坐标（X）、峰面积（Y）为纵坐标，得回归方程（表2），表明此方法在线性范围内各成分质量浓度与峰面积呈良好线性关系。

表2 黄酮和酚酸类成分对照品线性关系

2.5.5 精密度试验 称取某一供试品1 g，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，连续进样6 次，计算样品中7 个成分峰面积的RSD 分别为0.06%、1.03%、2.51%、1.62%、0.65%、0.61%、0.89%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 重复性试验 称取同一批供试品1 g，平行6份，按2.5.3项下方法制备供试品溶液，分别进样后计算样品中7 个成分质量分数的RSD 分别为0.24%、0.61%、2.14%、2.31%、1.83%、0.79%、0.76%，表明实验重复性良好。

2.5.7 稳定性试验 称取供试品1 g，按2.5.3 项下方法制备供试品溶液，分别放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后进样，计算样品中7个成分质量分数的RSD分别为1.70%、1.47%、2.52%、2.11%、1.54%、1.04%、1.62%，表明方法24 h内稳定性良好。

2.5.8 加样回收率试验 精密称定6份已知含量的供试品1 g，按质量比1∶1分别精密加入单一对照品溶液，按2.5.3 项下方法制备供试品溶液，进样后计算各成分的加样回收率。7个成分的加样回收率分别为101.09%、93.00%、89.83%、101.03%、103.15%、97.68%、90.24%，RSD 分别为2.90%、3.97%、6.74%、4.98%、3.21%、3.21%、2.87%，表明方法准确性良好。

2.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2010对数据进行整理，采用IBM SPSS Statistics 25.0对数据进行最小显著性差异法（LSD）多重比较分析、皮尔逊（Pearson）相关性分析和主成分分析（PCA）；采用GraphPad Prism 5.0软件作图。

3 结果

3.1 海拔对大别山区野生宽叶山蒿叶片性状和出绒率的影响

随海拔升高，宽叶山蒿叶长和叶宽呈先减小后增加的趋势，长宽比呈先升高后降低的趋势。海拔793、1550 m 的叶片最长，海拔793、1720 m 的叶片最宽；叶片长宽比越大，叶片越狭长，海拔894～1617 m的叶片比海拔793、1720 m 更狭长。出绒率随着海拔升高呈逐渐升高的趋势，海拔793 m出绒率最低，海拔894～1617 m次之，海拔1720 m的出绒率最高（表3）。

表3 不同海拔宽叶山蒿叶片性状及出绒率（±s,n=3）

表3 不同海拔宽叶山蒿叶片性状及出绒率（±s,n=3）

注：同列不同小写字母表示P<0.05；表5、表6同。

3.2 海拔对大别山区野生宽叶山蒿叶绒燃烧热解质量的影响

Ti反映了生物质燃料的着火性能或反应活化能的高低，其数值越小，表明该物料越易着火。宽叶山蒿叶绒的Ti为305.89～309.36 ℃，其中海拔1720 m 样品的数值最大，表明该海拔的宽叶山蒿叶绒最不易着火，见表4。

表4 不同海拔对宽叶山蒿叶绒燃烧热解质量的影响

RP为（46.60～50.60）%·min–1，其对应的TP为315.92～320.21 ℃。RP指燃烧过程中燃料最大失重速率，RP及TP反映了着火后的燃烧情况，RP越大，Tp越小，说明该燃料着火后的燃烧速度越快，燃烧稳定性越强。可见，各海拔宽叶山蒿叶绒在着火后的燃烧速度和稳定性相似。

Di反映燃料的点燃性能，数值越大越易点燃；Db反映燃料的燃尽性能，Db越大越难燃尽，同等燃烧条件下燃烧越持久。不同海拔宽叶山蒿叶绒 的Di为（2.04～2.25）%·min–3、Db为（2.04～2.25）%·min–4，可见，各海拔宽叶山蒿叶绒的点燃性能和燃尽性能相似。

S反映燃料的综合燃烧性能。S越大，燃料的综合燃烧性能越好。不同海拔宽叶山蒿叶绒S为（12.00～15.40）%2·min–2·℃–3，其中海拔1720 m 的S最小、综合燃烧特性较差，其余海拔的宽叶山蒿叶绒综合燃烧特性均相似。J反映燃料在燃烧过程中的放热能力和放热量，不同海拔宽叶山蒿叶绒的J为6 687.59～7 519.96 mJ·mg–1，其中海拔1720 m的宽叶山蒿叶绒燃烧放热量最少，其他海拔宽叶山蒿叶绒燃烧放热量相似。

除海拔1720 m 的宽叶山蒿叶绒综合燃烧特性较差及燃烧放热量较少外，各海拔宽叶山蒿叶绒的点燃性能、燃烧后的速度和稳定性、燃烧持久性、燃尽性能和燃烧过程的放热量均相似。

3.3 海拔对大别山区野生宽叶山蒿叶片挥发性成分的影响

7 个海拔宽叶山蒿叶片中共鉴定出91 个成分，其中共有成分27个，相对含量超过1%的有8个，分别为桉油精、1-壬烯-3-醇、龙脑、乙酸龙脑酯、α-古巴烯、石竹烯、大根香叶烯D和氧化石竹烯。8个成分均表现出不同程度的变异，变异系数为16.98%～49.77%，其中龙脑、乙酸龙脑酯、大根香叶烯D 和氧化石竹烯的变异系数均大于30%，表明这4个成分在7 个海拔存在较大差异。整体趋势为海拔≤1084 m桉油精、α-古巴烯、石竹烯和氧化石竹烯相对含量较高，高海拔乙酸龙脑酯、大根香叶烯D 相对含量较高（表5）。

表5 不同海拔宽叶山蒿叶片挥发性成分相对含量（±s,n=3）%

表5 不同海拔宽叶山蒿叶片挥发性成分相对含量（±s,n=3）%

3.4 海拔对大别山区野生宽叶山蒿黄酮和酚酸类成分的影响

海拔1720 m 样品6 种酚酸类成分质量分数均较大，而海拔793 m 样品新绿原酸和异绿原酸C 质量分数均较小，绿原酸在海拔894 m 样品中质量分数最小，海拔793、1074、1084、1617、1720 m 样品中均未检测到夏佛塔苷，海拔793、1074、1084 m样品均未检测到隐绿原酸。7 个成分在不同海拔样品中表现出不同程度的变异，变异系数为9.06%～162.67%，其中绿原酸、隐绿原酸、夏佛塔苷的变异系数均大于30%，隐绿原酸、夏佛塔苷的变异系数分别高达105.31%、162.67%，这2 个成分在7 个海拔样品间存在较大差异。中、高海拔样品中绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C质量分数较大（表6）。

表6 不同海拔宽叶山蒿叶片黄酮和酚酸类成分质量分数（±s,n=3）mg·g–1

表6 不同海拔宽叶山蒿叶片黄酮和酚酸类成分质量分数（±s,n=3）mg·g–1

注：ND表示未检测到。

3.5 海拔与大别山区野生宽叶山蒿叶片性状、出绒率、叶片成分的相关性

将海拔与野生宽叶山蒿的叶片性状、出绒率和叶片成分的相关数据导入IBM SPSS Statistics 23 软件中进行Pearson 相关分析（图4）。叶片长宽、叶片长宽比与海拔不相关，但出绒率与海拔呈正相关（P<0.01）。挥发性成分大根香叶烯D 相对含量与海拔呈正相关（P<0.01），氧化石竹烯相对含量与海拔呈负相关（P<0.01），其他挥发性成分相对含量与海拔无显著相关性。酚酸类成分绿原酸、隐绿原酸质量分数与海拔呈正相关（P<0.01），异绿原酸C质量分数与海拔呈正相关（P<0.05），其他黄酮和酚酸类成分质量分数与海拔无显著相关性。

图4 宽叶山蒿海拔、叶片性状、出绒率及成分相关性分析

3.6 PCA

对野生宽叶山蒿中8个挥发性成分和7个黄酮酚酸类成分进行PCA，发现有4 个主成分的初始特征值>1 且累积方差贡献率达到83.679%，因此提取了前4 个公共因子。由于15 个成分在4 个因子上的解释不明显，将原始因子载荷通过4 次方最大旋转后得到新的因子载荷（表7）。大根香叶烯D 和氧化石竹烯在因子1 中有较大载荷，异绿原酸B 在因子2中有最大载荷，夏佛塔苷在因子3 中有最大载荷，1-壬烯-3-醇在因子4 中有最大载荷。4 个因子的方差贡献率差异较小，可以考虑选取上述5 个成分作为宽叶山蒿的评价指标。根据主成分因子的特征值计算各成分对应的特征向量，根据方差贡献率构建宽叶山蒿挥发性成分和黄酮酚酸类成分的评价函数：Y=0.276 59y1+0.212 58y2+0.198 36y3+0.149 25y4+0.108 52y5。将15 个成分标准化后的数据带入公式，得到不同海拔宽叶山蒿叶片成分的综合得分值（表8），表明在高海拔地区宽叶山蒿综合得分较高。

表7 宽叶山蒿旋转后主成分因子载荷

表8 不同海拔宽叶山蒿叶片成分综合得分及排名

4 讨论

海拔对植株的生长影响较大，对叶片的影响较明显[10-12]。本研究发现，在海拔793～1720 m，单株中部叶片长、宽、长宽比有一定的差异，海拔793 m叶片长、宽、叶面积最大，而海拔894、1720 m 叶片长、宽、叶片面积最小。海拔793、1720 m 样品叶片长宽比小于其他海拔样品，说明这2 个海拔的叶片为椭圆形，但叶片长、宽、长宽比与海拔无显著性相关。以上表明，海拔作为较为重要的环境因子，对野生宽叶山蒿的叶片性状产生了一定影响。

非腺毛是植物长期进化形成的应对恶劣环境的特殊结构，具有抗旱保水、抗强光辐射、抗风沙、调节蒸腾和光合作用的重要作用[13]。本研究中，出绒率随着海拔升高逐渐增加，推测宽叶山蒿为适应海拔升高所引起的温度降低、辐射增加等恶劣环境而分化出更多的非腺毛。

叶绒的燃烧质量受纯度、规格等多种因素的影响[14-15]。本研究发现，海拔1720 m 的宽叶山蒿叶绒综合燃烧特性较差、燃烧放热量较少，其余各海拔宽叶山蒿叶绒的点燃性能、燃烧后的速度和稳定性、燃烧持久性、燃尽性能和燃烧过程的放热量均相似，表明海拔对野生宽叶山蒿叶绒燃烧性能的影响不显著。

药用植物有效成分如黄酮类、生物碱类等，在植物体内的积累受海拔直接或间接影响[16-19]。在海拔793～1720 m，野生宽叶山蒿挥发性成分含量有一定差异，一般在低、中海拔样品中桉油精、α-古巴烯、石竹烯和氧化石竹烯相对含量较高，高海拔样品中乙酸龙脑酯、大根香叶烯D 相对含量较高，其中海拔对龙脑、乙酸龙脑酯、大根香叶烯D 和氧化石竹烯4 个挥发性成分的影响较大。随海拔升高，大根香叶烯D 相对含量逐渐增加，氧化石竹烯相对含量逐渐减少。PCA 显示，大根香叶烯D 和氧化石竹烯在因子1 中的贡献度最大，故在8 个挥发性成分中，大根香叶烯D 和氧化石竹烯作为重要的评价指标。在不同海拔野生宽叶山蒿的黄酮酚酸类成分质量分数差异显著，一般中、高海拔样品中绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸C 质量分数较高，海拔明显影响了隐绿原酸和夏佛塔苷的质量分数，随着海拔升高，绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C 质量分数均逐渐增加。在因子1 中绿原酸和隐绿原酸有较大载荷，因子2中异绿原酸C 具有较大载荷，故在7个黄酮酚酸类成分中，绿原酸、隐绿原酸和异绿原酸C 能作为评价指标。根据叶片成分的综合评价函数，高海拔区域野生宽叶山蒿叶片成分综合得分最高。

5 结论

综上所述，大别山区野生宽叶山蒿出绒率随海拔升高逐渐增加；除海拔1720 m 的宽叶山蒿叶绒综合燃烧特性较差及燃烧放热量较少外，各海拔宽叶山蒿叶绒的点燃性能、燃烧后的速度和稳定性、燃烧持久性、燃尽性能和燃烧过程的放热量均相似；高海拔区域宽叶山蒿叶片成分综合评价较好。海拔造成的环境差异可能是导致野生宽叶山蒿叶片性状、出绒率、叶绒燃烧热解质量和叶片成分含量差异的重要因素。不同海拔采集的宽叶山蒿是否存在遗传分化仍有待进一步研究。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。