苦参碱对骨肉瘤细胞凋亡的影响*

王利宁，赵新芝，宋军帅，王淑燕，孙广玉，李克明，杨真真

（1.山东省乳山市人民医院，山东威海 264599； 2.山东省中医药研究院，山东济南 250014； 3.山东省滨州市人民医院，山东滨州 256600； 4.山东省济南市第四人民医院，山东济南 250031）

骨肉瘤（OS）是儿童和青少年最常见的原发性骨癌，是继软骨肉瘤和脊索瘤后第三大常见骨癌，具有极强的侵袭性和破坏性，临床表现为肿瘤、疼痛、跛行等［1-2］。且在确诊后的1 年内有80%～90%的患者会出现肺转移［3-6］，转移后患者的5 年生存率仅有20%～30%［7-9］。目前，OS的发病机制并未阐明。OS发生早期，主要应用手术切除，但预后较差；化学治疗（简称化疗）有一定的作用，但会产生严重的骨髓抑制、肝肾功能障碍及高耐药性［10-11］。中药单体在临床肿瘤治疗上发挥了积极作用。苦参碱提取自苦参，具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫等作用［12-13］，能抑制多种肿瘤细胞生长［14］，如通过糖代谢途径抑制胃癌细胞转移［15］。多项研究表明，苦参碱可通过调控丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶（AKT）、Bcl-2关联X蛋白（Bax）等因子的表达，而抑制人OS细胞的增殖与凋亡［16-21］。细胞外信号调节激酶5（ERK5）属有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，对细胞存活、增殖、迁移、分化等多项生物反应均有调节作用［22］，可通过金属蛋白酶9（MMP - 9）调节OS 细胞的侵袭性［23］，经磷酸化后还可参与细胞凋亡［24］。丝裂原激活蛋白激酶5（MEK5）是ERK5的唯一调节因子，激活后对下游效应因子c-myc 和Nur77 具有调节作用［25］，其中c-myc、胱天蛋白酶9（caspase- 9）在细胞周期中扮演重要角色［26］，可激活多种信号靶点，并促进细胞凋亡［27］。为此，本研究中探讨了苦参碱对ERK5信号通路的调控作用及机制，以期为OS的治疗提供思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药、细胞与动物

仪器：Imark - 22353 型多功能酶标仪，PowerPac Basic 电泳仪，均购于美国Bio - Rad 公司；C6 Plus 型流式细胞仪（美国BD Bioscience 公司）；CFX 96 型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（Bio - Rad Laboratories，Inc.）；Hema 9600 型基因扩增仪（珠海黑马医学仪器有限公司）；Ni-V 型研究级正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；Tanon5200 型全自动化学发光图像分析仪（上海天能科技有限公司）。

试药：苦参碱（陕西金康泰生物科技有限公司，CAS号为519 - 02 - 8，纯度为98%）；CCK - 8 试剂盒（批号为A311 - 02 - AA），凋亡试剂盒（批号为A211 - 02），均购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DMEM 培养基（HyClone，批号为SH3002201），胎牛血清（Biological Industries，批号为04 - 001 - 1ACS），c - myc（批号为A1309，稀释比例为1∶1 000），caspase - 9（批号为A11910，稀释比例为1∶1 000），Nur77（批号为A6676，稀释比例为1∶1 000），均购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；内参三磷酸甘油脱氢酶（GAPDH，批号为10494-1-AP，稀释比例为1∶20 000），MEK5磷酸化抗体（批号为15758-1-AP，稀释比例为1∶1 000），均购于武汉三鹰生物技术有限公司；二抗（Cell Signaling Technology，批号为#7074，稀释比例为1∶1 000）；XMD - 892（Creative Enzymes，批号为CEL-1585）；荧光二抗（Cell Signaling Technology，4412S，稀释比例为1∶100）；荧光定量PCR 相关试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），引物由北京擎科生物科技有限公司设计，引物序列见表1。

表1 mRNA扩增的基因引物序列Tab.1 Geneprimer sequences for mRNA amplification

细胞：人成骨肉瘤细胞株MG-63（ATCC）。

动物：雄性SPF 级SD 大鼠20 只，6～8 周龄，体质量160～200 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号为SCXK（鲁）20190003。饲养于室温25 ℃、相对湿度50%～60%、每12 h明暗交替的环境中，均自由摄食、饮水。本研究中动物实验程序均经实验动物福利与伦理委员会批准，实验过程中的所有操作均符合“3R”原则。

1.2 方法

苦参碱含药血清制备：SD 大鼠适应性喂养1 周后，随机分为0 浓度组和10%苦参碱组，各10 只，分别灌胃生理盐水和10%苦参碱，每日2 次，连续3 d。第3 天灌胃前，禁食不禁饮12 h，于末次给药1 h 后，腹腔注射麻醉药物，腹主动脉取血；血样于4 ℃条件下离心（转速为3 000 r/min）10 min，收集上层血清，于56 ℃水浴中灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜滤过，保存于-80 ℃冰箱，待用。

细胞培养：细胞接种于加10%胎牛血清DMEM 培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。后续实验均基于对数生长期的细胞开展，均重复3次。

CCK-8法检测苦参碱对MG-63细胞增殖的影响：将细胞混悬液接种至96孔板中，每孔100 μL，培养24 h后，加入0 浓度组和10%苦参碱组的苦参碱含药血清。分别于培养24，48，72，96 h 时加入CCK - 8 试剂，于37 ℃恒温培养箱中继续培养40 min，观察液体颜色是否变黄。采用酶标仪于450 nm波长处检测各孔的吸光度（OD）值，计算细胞活力。细胞活力（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

流式细胞术检测苦参碱对MG-63细胞凋亡的影响：将细胞混悬液接种至6孔板中培养24 h后弃去废液，加入0 浓度组和10%苦参碱组苦参碱含药血清干预48 h后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次，离心，弃去上清液，轻轻吹打，加300 μL 的1×Bind buffer 到细胞中，重悬。按试剂盒说明书依次加入Annexin V（FITC，5 μL）和碘化丙啶（PI，5 μL），避光孵育15 min，于1 h 内用流式细胞仪测定细胞凋亡数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率（%）=（早期凋亡细胞数+ 晚期凋亡细胞数）/总细胞数×100%。

定量PCR检测MG-63细胞凋亡相关基因转录情况：将细胞接种至6 孔板中，培养24 h 后加入0 浓度组和10%苦参碱组苦参碱含药血清，干预48 h，提取总RNA，按Vazyme 逆转录及PCR 试剂盒说明书，在荧光定量PCR 仪上进行PCR 扩增检测。以β-肌动蛋白（βactin）为内参，用2-ΔΔCt公式计算目的基因（c - myc，caspase-9）的相对表达水平。

免疫印迹（Western blot）法检测MG - 63 细胞蛋白表达水平：前期研究证明，苦参碱可抑制ERK5 蛋白信号的表达，且MEK5 是ERK5 信号通路的唯一激活剂［28］；Nur77 又受ERK5 调控，本研究中检测MEK5 和Nur77 蛋白表达水平。细胞接种于6 孔板中，分为0 浓度组和10%苦参碱组，探讨苦参碱促凋亡的分子机制；分为0浓度组，10%苦参碱组，XMD8-92组，10%苦参碱+XMD8 - 92 组，探讨苦参碱通过ERK5 信号通路调控MG - 63 细胞凋亡的作用；分为0 浓度组，10%苦参碱组，vector 组（10%苦参碱+ CMV - MEK5aCA），MEK5组（CMV - MEK5aCA），探讨过表达ERK5 信号通路上游蛋白MEK5时苦参碱如何调控细胞凋亡。分别培养24 h后，提取总蛋白，制备上样缓冲液，取30 μg 蛋白上样，电泳条件设置为恒压80 V、30 min，后转为120 V、60 min，转膜条件设置为恒流180 mA、120 min，用5%脱脂牛奶封闭2 h，待封闭结束用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，4 ℃条件下一抗孵育过夜，回收一抗TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，加入二抗，室温慢摇2 h。继续清洗，使用电致化学发光（ECL）剂在凝胶成像系统中进行显影分析。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0.2（263）软件进行数据分析及统计作图。数据以±s表示，组间比较采用one -way ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 降低MG-63 细胞活力

与0 浓度组相比，随着药物作用时间的延长，10%苦参碱组OD值增速逐渐变小，提示细胞活力被逐渐抑制，苦参碱能抑制MG-63细胞增殖，且呈时间依赖性。详见图1和表2。

图1 CCK-8法检测不同浓度苦参碱含药血清对MG-63细胞增殖的影响Fig.1 Effect of different concentrations of matrine - containing serum on the proliferation of MG - 63 cells detected by the CCK - 8 method

表2 不同浓度苦参碱组不同时间OD值比较（±s）Tab.2 Comparison of OD values in matrine groups with different concentrations at different times（±s）

表2 不同浓度苦参碱组不同时间OD值比较（±s）Tab.2 Comparison of OD values in matrine groups with different concentrations at different times（±s）

时间第1天第2天第3天第4天0浓度组0.667±0.074 6 1.544±0.135 2.211 25±0.153 2.775 5±0.233 10%苦参碱组0.447±0.129 1.313 5±0.303 1.802 25±0.11 2.090 5±0.112

2.2 促进MG-63 细胞凋亡

与0浓度组相比，10%苦参碱组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），提示苦参碱能显著促进MG-63 细胞凋亡。详见图2。

A.流式散点图 B.柱状图注：与0浓度组相比，**P < 0.01，***P < 0.001。图3至图6同。Q1 - LR为早期凋亡细胞，Q1 - UR为晚期凋亡细胞。图2 苦参碱对MG-63细胞凋亡率的影响A.Flow scatter B.Bar chartNote：Compared with those in the non - matrine group，**P < 0.01 and ***P < 0.001（for Fig.2 - 6）.Q1 - LR refers to early apoptotic cells，and Q1 - UR refers to late apoptotic cells.Fig.2 Effect of matrine on the apoptosis of MG - 63 cells

2.3 调控MG-63 细胞凋亡相关基因转录水平

与0 浓度组相比，10%苦参碱组caspase-9 基因表达水平显著升高（P<0.01），c-myc基因表达水平显著降低（P< 0.001），表明苦参碱能通过调控凋亡相关基因促进细胞凋亡。详见图3。

A.caspase - 9 B.c - myc图3 定量PCR检测凋亡相关基因表达A.caspase - 9 B.c - mycFig.3 Detection of apoptosis - related gene expression by the RT - PCR

2.4 抑制ERK5 信号通路相关蛋白表达

与0浓度组相比，10%苦参碱组MEK5和Nur77蛋白表达水平均显著降低（P<0.001），表明苦参碱对ERK5信号通路中上下游蛋白具有明显调控作用。详见图4。

A.电泳图 B - C.蛋白计数图图4 Western blot法检测MEK5和Nur77蛋白表达情况A.Electropherogram B - C.Protein countFig.4 Detection of MEK5 and Nur77 protein expression by the Western blot

2.5 通过ERK5 信号通路调控MG-63 细胞凋亡

与0 浓度组相比，10%苦参碱组、XMD8 - 92 组、10%苦参碱+XMD8-92 组c-myc 蛋白表达水平显著降低（P<0.01），XMD8-92组、10%苦参碱+XMD8-92组caspase-9蛋白表达水平显著升高（P<0.001），表明苦参碱与ERK5 抑制剂XMD8 - 92 具有相似性，对ERK5信号通路具有抑制作用。详见图5。为进一步证明苦参碱通过ERK5 信号通路调控MG-63 细胞周期与凋亡，通过过表达唯一上游蛋白MEK5，并检测c - myc 和caspase - 9 蛋白表达水平进行验证。与0 浓度组相比，10%苦参碱组c-myc蛋白表达水平显著降低（P<0.001），caspase-9 蛋白表达水平显著升高（P<0.001）。与vector 组相比，MEK5 组c - myc 蛋白表达水平显著升高（P<0.01），caspase-9蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。表明ERK5 对MG-63 细胞凋亡具有调控作用，蛋白表达与细胞凋亡呈负相关。详见图6。

3 讨论

OS是临床常见恶性肿瘤，好发于青少年发病率高，存活率低［22］。目前治疗手段主要为手术治疗与化疗，但患者预后效果差，生活质量低，且常伴随耐药与疾病复发率高的困扰［27］。因此，抑制肿瘤生长及缓解化疗耐药是当前亟待解决的问题，使肿瘤细胞凋亡是解决以上问题的重要手段［24-25］。

苦参始见于《神农本草经》，用于治疗症瘕积聚。主要成分为苦参碱［27-28］。现代药理学研究发现，苦参碱通过信号转导与转录活化因子3（STAS3）通路增强阿霉素化疗对OS的疗效［29］，能促进OS细胞凋亡［30］。与顺铂治疗小鼠OS相比，高浓度苦参碱能明显减少肿瘤质量，诱导肿瘤组织凋亡，其主要作用途径可能与FAS/FASL的表达及与caspase-8 的活化有关。邹敏等［17］、李国慧等［15］将苦参碱作用于MG - 63 细胞后，发现细胞增殖能力下降，其主要原因为细胞凋亡率升高，与本研究结果一致。此外，尚剑等［16］发现苦参碱抑制MG - 63 细胞DNA 合成，阻滞细胞在S 期，同时激活caspase - 3，caspase-8，caspase-9蛋白的表达，从而导致细胞程序性死亡。Caspase 家族在细胞凋亡过程中被激活［31-32］，参与内源性与外源性凋亡途径［33-36］。外源性凋亡以线粒体途径为主，caspase-9作为本途径的启动蛋白发挥重要作用［37-38］。

细胞凋亡率降低是化疗耐药性产生的重要因素，因药物促进细胞凋亡是OS治疗的研究热点。研究表明，ERK5 属MAPK 家族，在细胞存活、增殖、迁移、分化等多项生物反应中具有调节作用［39-40］。MEK5处于ERK5的上游，是其唯一调节因子，ERK5 激活后对下游效应因子c-myc 和Nur77 具有调节作用［24］，c-myc 在细胞周期中扮演重要角色［25］，其激活后可激活多种信号靶点促进细胞凋亡［26］。有研究表明，ERK5 磷酸化后调节Nur77可参与细胞凋亡［27］。

本研究结果显示，苦参碱对细胞增殖的抑制作用明显，同时对细胞凋亡有显著促进作用。抑制细胞周期标志性蛋白c - myc 表达，而对线粒体凋亡启动蛋白caspase-9 具有明显激动作用。c-myc 蛋白表达下调，抑制细胞周期活性，启动细胞凋亡信号通路，从而抑制细胞增殖，促进凋亡。为验证苦参碱通过ERK5 信号通路调控MG - 63 细胞凋亡，分别加入ERK5 抑制剂XMD8-92、过表达其上游信号MEK5。过表达MEK5，周期蛋白c-myc降低，凋亡蛋白caspase-9上升；加入ERK5抑制剂XMD8-92后，c-myc上升，caspase-9下降。可见，苦参碱作用于MG-63细胞的效果与抑制剂XMD8-92相当，且XMD8-92联合苦参碱的效果更明显。

综上所述，苦参碱通过ERK5信号通路调控MG-63细胞凋亡及相关蛋白caspase - 9 和c - myc 的表达。本研究结果可为OS 的治疗提供新思路，拓展中医药治疗恶性疾病的研究方向。