超高效液相色谱- 串联质谱法快速定性和定量筛查贴敷类医疗器械产品非法添加的水杨酸甲酯

刘路，皮璟渔，余永红，刘小辉，胡红刚，梁国东

江西省医疗器械检测中心 （江西南昌 330000）

现代生活强度高、节奏快，许多人或因长期体 力劳动，或因长期对着电脑及手机，身体处于亚健康状态，并伴肩颈、腰椎、关节等疼痛。为缓解此类症状，一般选择贴膏剂药物和贴敷类医疗器械产品。此两类产品省时、方便、见效快，市场前景广阔。其中贴敷类医疗器械产品包括医用冷敷贴、远红外贴、穴位刺激贴、降温贴、热疗贴、热灸贴等，属于第一类医疗器械。国家药品监督管理局于2021 年12 月组织修订的《第一类医疗器械产品目录》[1]中明确强调，该类医疗器械产品中不能含有中药（薄荷、麝香、肉桂、艾叶等）、化学药物（水杨酸、水杨酸甲酯、布洛芬、盐酸利多卡因等）、生物制品（血清白蛋白、细胞因子、酶、干扰素等）、消毒和抗菌成分（次氯酸、盐酸奧替尼啶、苯扎溴铵等）、天然植物（洋甘菊、百里香、薄荷脑、薄荷醇等）及其提取物等发挥药理学、免疫学、代谢作用的成分或者可被人体吸收的成分。患者若对产品成分潜在风险不了解，长期大量使用、错误使用可能会产生许多不良反应，严重损伤机体的生命系统，威胁患者的生命安全[2-5]。

液相色谱-串联质谱法快速测定其非法添加化学成分（如双氯酚酸钠、泼尼松、萘普生、布洛芬、吲哚美辛、保泰松、氢化可的松、酮洛芬、醋酸泼尼松、对乙酰氨基酚等）的报道较多[6-10]，但对水杨酸甲酯含量测定的报道较少。查询相关文献，水杨酸甲酯的检测方法主要有液相色谱法[11，15-16]和气相色谱法[12-13]，且多针对药品，包括橡胶膏剂[11-12]、药油[13]、软膏[14-15]、片剂、胶囊剂等[16-18]，但关于高分辨液相色谱-质谱联用法的报道较少。

目前针对腰腿疼痛有活血化瘀、消肿止痛的贴膏剂和贴敷类医疗器械。而贴敷类医疗器械基质复杂，多含有粘贴层，胶状物成分不明，一般包括医用压敏胶和远红外陶瓷粉，气相、液相色谱法检测易出现假阳性。本研究以贴敷类医疗器械为对象，采用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定，利用色谱的分离能力和串联质谱的高选择性，实现对目标物的分离、确认和定量分析，旨在为敷贴类医疗器械的市场监督管理提供技术支持与参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UPLC-XEVO-TQD 高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters 公司，配置电喷雾离子源ESI）、ME5 超微量电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]， BT25S 电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，CLXXUVFM2 超纯水器（威立雅集团上海公司），HH-8 恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司）。

水杨酸甲酯对照品（纯度100.0%，中国食品药品检定研究院）；甲醇（质谱纯，Honeywell公司）；甲醇（色谱纯，Honeywell公司）；氨水（质谱纯，Aladdin 公司），实验用水为符合GB/T 6682-2008 的二级水。

供试样品为各大药房和网络购买所得贴敷类医疗器械。

1.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品0.01 g（精确至0.01 mg），置于10 ml 棕色容量瓶中，加色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1 mg/ml 的对照储备溶液。分别取适量对照储备溶液于10 ml 棕色容量瓶中，用色谱纯甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，得1～100 μg/ml 水杨酸甲酯对照系列溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 供试品溶液的制备

取样品1 贴，撕开粘贴层，贴在定量滤纸上，用剪刀裁去多余滤纸，然后将样品剪成0.5 cm×0.5 cm的小片，置于150 ml 烧瓶中，加入色谱纯甲醇40 ml，置于恒温水浴锅内70℃连续回流2 次，每次2 h；合并浸提液并用色谱纯甲醇分3 次冲洗烧瓶，再用色谱纯甲醇定容至100 ml 容量瓶，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后进样分析，同法制备空白溶液进行比较。

1.3.2 仪器条件

液相色谱条件：WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相A 为0.05%氨水，B 为质谱纯甲醇，按表1 进行梯度洗脱；流速为0.2 ml/min，进样量为10 μl；柱温为40 ℃。 质谱条件：电离方式为电喷雾电离负离子模式、质谱扫描方式为多反应离子监测、毛细管电压为2.50 kV、脱溶剂温度为500 ℃、脱溶剂气流为1000 L/h，其他参数见表2。

表1 UPLC 流动相梯度洗脱程序

表2 水杨酸甲酯的回收率实验结果（n=6）

2 结果与分析

2.1 质谱参数的优化

将质量浓度为10 μg/ml 的水杨酸甲酯对照溶液进行一级质谱全扫描和二级质谱轰击，以目标物的分子离子和丰度较强、干扰较小的子离子组成离子对进行监测。同时对特征离子及离子间的丰度比作定性分析、丰度最高的特征离子作定量分析，以提高方法的准确性和专属性。质谱的锥孔电压和碰撞对目标物的裂解起着重要作用，因此重点优化毛细管电压、锥孔电压和碰撞能，以进一步提高该方法的灵敏度。实测水杨酸甲酯在8.12 min处出现色谱峰，响应的MRM 母离子为151 m/z，子离子为91 m/z、121 m/z，选取91 m/z 为定量离子、121 m/z为定性离子，碰撞电压为18 eV，锥孔电压为26 eV。

2.2 色谱参数的优化

本实验从灵敏度、分离效果、分析时间、峰形方面综合考虑BEH C8 柱、 C18 柱，最终选择BEH C18 柱。流动相的选择中，观察乙酸铵（2 mmol/L、10 mmol/L）-甲醇、乙酸铵（2 mmol/L、10 mmol/L）-乙腈、甲酸水（0.05%、0.10%）-甲醇、氨水（0.05%、0.1%、0.2%）-甲醇等多个系统，发现在酸性环境下，对水杨酸甲酯的电离具有抑制作用，导致质谱没有响应，需使用碱性试剂提高离子化效率、增加信号强度，故采用氨水-甲醇系统。通过考察不同浓度的氨水（0.05%、0.1%、0.2%）发现氨水浓度为0.05%时，水杨酸甲酯的峰形、响应值均较好，选择0.05%氨水-甲醇作为流动相。鉴于碱性流动性对仪器的损伤较大，分析0.20、0.25、0.30 ml/min 的流速后，采用0.2 ml/min 的流速。

2.3 方法验证

2.3.1 专属性试验

取“1.2 项下的对照品溶液的制备”的溶液，按“1.3.2”项下条件进样测定，水杨酸甲酯定性和定量离子对的MRM 图见图1。取阳性样品、空白样品分别按照“1.3.1”项下方法制备，按“1.3.2”项下条件进样测定，阳性样品、空白样品的定性和定量离子对的MRM 图分别见图2～3。从图1、图2 中可以看出，对照品和阳性样品的峰型对称、尖锐，分离度良好，基线较为平稳，且阳性样品中的定性离子、定量离子的保留时间及离子丰度比均与对照品的保留时间、离子丰度比一致，则予以确认含有同一物质。从图3 中可看出，空白样品的定性和定量离子出峰时间、离子丰度比均不一致，则不予确认，表明该方法专属性较强。

图1 对照品定性和定量离子对的MRM 图

图2 阳性供试品定性和定量离子对的MRM 图

2.3.2 线性关系考察

配制质量浓度为1 、2、4、6、8、10、20、50、80、100 μg/ml 水杨酸甲酯标准系列溶液，按“1.3.2”测定，以定量离子的峰面积值对浓度进行线性回归，线性方程为y=0.50307x+191.14（r=0.9997），结果表明，相关系数r>0.999，水杨酸甲酯 1～100 μg/ml范围内线性关系良好。

2.3.3 检出限

UPLC-MS/MS 使目标物的精确质量数提取，基线噪音很低，信噪比一般较大，因此本实验不选择S/N 为3∶1 的浓度作为化合物检出限，S/N 为10∶1 的浓度作为化合物定量限[8]，而是逐级稀释对照品溶液，以最小响应信号所对应的浓度作为检出限，然后以检出限的3 倍确定定量限，实验测得检出限为0.1 μg/ml、定量限为0.3 μg/ml。

2.3.4 精密度

取样品按“1.3.1”方法制备的供试品溶液、质量浓度为50 μg/ml 的对照品溶液，分别连续测定6 次。在MRM 模式下计算提取定量离子峰面积的相对标准偏差（relative standard de-viation，RSD）为0.7%（n=6），结果显示方法的精密度良好。

2.3.5 回收率

选取阴性样品分别添加0.1、0.5、2 mg 3 个水平进行加标回收实验，每个水平各6 份样品，按照“1.3.1”处理、“1.3.2”测定，结果显示回收率为90.3%～100.7%，RSD 为0.5%～0.9%，表明回收率良好，见表2。

2.3.6 稳定性

取阳性样品，按照“1.3.1”处理、“1.3.2”分析，分别在0、12、24、30、36、48 h 测定。在MRM模式下计算提取定量离子峰面积的RSD 为0.6%，RSD<5%（见表3），表明阳性样品中的目标物48 h内稳定性良好。

表3 水杨酸甲酯的稳定性实验结果

2.4 样品制备方法的分析

本研究对贴敷类医疗器械产品进行探讨，患者在使用产品时贴于患处，一般以1 贴为1 次用量，贴的大小与患者的部位有关，因此以1 贴为实验用量。参照相关文献[6，14]，选择甲醇为样品的浸提溶剂并采取冷凝回流的方式，获得浸提液。供试样品为各大药房和网络购买所得贴敷类医疗器械，部分贴敷类医疗器械产品名称及宣称功效举例见表4。以铁粉或其他粉末致热为工作原理的热疗贴、热灸贴等贴敷类医疗器械一般含有发热粉剂，且发热粉剂不接触皮肤，不适用于此样品制备方法。

表4 部分贴敷类医疗器械产品名称及宣称功效举例

2.5 贴敷类医疗器械产品中水杨酸甲酯的测定

采用建立的UPLC-MS/MS 方法对市售和网购的贴敷类医疗器械产品（包括医用冷敷贴、医用冷敷凝胶、远红外镇痛贴、晕车贴、鸡眼贴等）是否添加水杨酸甲酯进行检测。114 份样品中，共检出阳性样品29 份，检出率为25.4%，含量为每贴1～47 mg，且阳性样品多集中在医用冷敷贴、远红外镇痛贴样品中。

3 讨论

面对日益复杂的贴敷类医疗器械产品质量安全形势，检验、检测能力亟需高质量发展，以满足安全监管的需要。气相、液相色谱法是筛查食品、药品中非法添加物常用的方法，但由于贴敷类医疗器械基质复杂，成分不明，基质中的其他成分可能与水杨酸甲酯具有相同的保留时间，所以需高分辨的质谱数据提供准确可靠的信息[5]，所以通常利用色谱法进行初筛，再用UPLC-MS/MS 法验证，试验过程步骤多且复杂，耗时过长。本研究通过质谱、色谱条件的优化及方法学验证，证明本研究建立的UPLC-MS/MS 法简便可靠、快速高效，可有效对贴敷类医疗器械产品中是否添加水杨酸甲酯进行监测。另外，贴敷类医疗器械非法添加成分繁杂，可参考文献[6-9]与本研究方法同时测定多种成分，省时省力，为批量处理分析样品提供便捷。本研究对114 份样品进行测定，发现阳性样本29 份，满足对目标物进行精准分析的要求，进一步验证了该方法可用于大批量样品检测的有效性和实用性。