高效液相色谱法测定肝复颗粒中6 种成分含量

吴国军，徐惠玲，龚艳珍（通信作者）

江西省人民医院 （江西南昌 330006）

肝复颗粒是一种中成药，主要由虎杖、冷水花、吉祥草、苦参、黄柏、丹参、栀子等7 味药材组成, 具有疏肝利胆、活血化瘀、清热解毒等功效，主要用于治疗气滞血瘀、肝胆湿热所致的急慢性肝炎。方中虎杖的主要成分为虎杖苷和大黄素，具有护肝的作用[1-2]；栀子的有效成分为栀子苷和西红花苷类，具有保肝、抗癌等作用[3-4]；丹参中丹参酮类成分主要具有保护肝脏、抗菌消炎的作用[5-6]。

《中国药典》[7]的原有标准收载中记载了栀子苷的定量限定，但是关于其他成分测定的相关研究较少。研究证实，复方中药成分复杂，其疗效由方中药材独立或相互作用决定，各药材所占比例将影响整个药方的疗效[7-10]。因此，评价复方中药的疗效需多成分测定。本研究采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定肝复颗粒中6 种成分（虎杖苷、西红花苷Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、栀子苷）的含量，以期全面、客观地评价肝复颗粒的药效成分，现报道如下。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

高效液相色谱仪（山东鲁创分析仪器股份有限公司，型号：LC-500）；高精度电子天平（上海赞维衡器有限公司，型号：ZA505AS）；恒温水浴锅（常州国宇仪器有限公司，型号：HH-s6）；数控超声波清洗器（北京东南仪诚实验室设备有限公司，型号：KQ5200DV）。

1.2 药品与试剂

对照品栀子苷（批号：110749-201919）、虎杖苷（批号：111575-201603）、隐丹参酮（批号：110852-201807）、丹参酮Ⅰ（批号：110867-201607）、丹参酮ⅡA（批号：110766-202022）均购自中国食品药品检定研究院，西红花苷Ⅰ（上海泽叶生物科技有限公司，批号：ZY67302SD），色谱纯乙腈（上海优试化工有限公司，批号：20200322），色谱纯甲醇（广州浩盈化工科技有限公司，批号：20200310）。肝复颗粒共12 批，生产厂家为贵州君之堂制药有限公司（批次分别为：200201、200202、200203、200204、020401、200402、200403、200404、200701、200702、200703、200704）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：COSMOSIL C18（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）。流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）。以0.8 ml/min 流速梯度洗脱（0～10 min，A：2%→16%；10～15 min，A：16% →16%；15～20 min，A：16%→50%；20～23 min，A：50%→70%；23～26 min，A：70% →2%；26～30 min，A：2%），检测波长为205 nm，柱温为40 ℃，进样量为10 μl。

2.2 配制对照溶液

同一25 ml 容量瓶中放入适量的虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、西红花苷Ⅰ、栀子苷为对照品，加甲醇溶解制成每毫升含虎杖苷0.28 mg、隐丹参酮0.36 mg、丹参酮Ⅰ0.44 mg、丹参酮ⅡA 0.14 mg、西红花苷Ⅰ 0.22 mg、栀子苷0.12 mg 的混合溶液，备用。

2.3 配制供试品溶液

取肝复颗粒研磨成均匀细粉，称量0.5 g，放入具塞锥形瓶中，添加色谱纯甲醇溶解，称定质量，超声（功率为250 W，频率为40 kHz）提取30 min 取出、放冷，加色谱纯甲醇补足质量，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤后得所需滤液。

2.4 配制阴性供试品溶液

按照颗粒制备工艺，分别制备小样虎杖、丹参及栀子阴性颗粒，并按“2.3”方法分别制备阴性溶液。

图1 各样品高效液相色谱图

2.5 方法学

2.5.1 线性试验

采用甲醇按比例稀释“2.2”中混合对照品储备液，分别稀释2、10、50、100 倍。按色谱条件进样，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，计算对照品的回归方程及相关系数，见表1。

表1 6 种成分的线性关系

2.5.2 精密度试验

根据“2.1”方法色谱条件将混合对照品连续进样 6 次，记录峰面积、保留时间，虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、西红花苷Ⅰ、栀子苷的相对标准偏差（relative standard devition，RSD）分别为0.22%、0.42%、0.83%、0.17%、0.31%及0.24%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性

称量6 份颗粒粉末，按供试品制备方法制得样品 6 份，根据“2.1”方法色谱条件测定，记录保留时间、峰面积，计算虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、西红花苷Ⅰ、栀子苷的平均含量分别为1.7427 、1.3941 、1.2448 、0.7967 、0.4481 mg/g，RSD 分别为1.31%、0.26%、1.55%、0.38%、1.31%及0.25%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性

根据“2.1”方法色谱条件分别对制备后 0、2、4、8、12、24 h 试品溶液进行测定，记录峰面积、保留时间，计算虎杖苷、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、西红花苷Ⅰ、栀子苷的RSD 分别为0.34%、1.28%、1.37%、0.61%、1.28% 及1.23%，表明供试品溶液24 h 内稳定性良好。

2.5.5 加样回收率

在具塞锥形瓶中放入已知含量的样品0.5 g，6 份，按100%加入6 个对照品，按照“2.3”实验方法制成供试品溶液，测定溶液中成分的含量并计算回收率，同时以溶液检测时的信噪比S/N ≥3 作为最低检测限，见表2。

表2 加样回收率结果

2.5.6 系统适应性

参照《中国药典》[7]2015 年版第4 部“0512 高效液相色谱法”中系统适应性试验进行考察，结果其柱效、分离度、灵敏度、重现性等均符合规定，故可用于含量测定。

2.6 样品含量测定

取12 批次样品，分别按“2.3”方法制备供试品溶液各3 份，每个溶液按“2.1”色谱条件进样测定2 次，记录峰面积，并按外标法计算虎杖苷、西红花苷Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、栀子苷的含量，见表3。

2.7 数据分析

将表3 中的定量数据采用SIMCA 13.0 软件进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal PLS-DA，OPLS-DA）分析，结果如图2 所示，12 个批次的肝复颗粒分为3 类，通过不同月份的生产批次区分，其成分含量差异与不同月份颗粒样品的相对应。

图2 PCA 和OPLS-DA 分析结果

此外，定量数据经SPSS 的聚类分析和因子分析后，结果见图3，12 批次的颗粒样品可分为3 类，均与月份样品相对应。此结果与PCA 的分析一致。因子分析中，以特征值>1，方差贡献率>80%为标准，发现成分1 和2 为主要的影响成分。由碎石图和方差累积值（表4）可知，栀子苷和西红花苷Ⅰ是影响差异的主要成分。

表4 解释的总方差

图3 聚类分析和因子分析结果

3 讨论

本实验同时测定肝复颗粒中6 种成分，将乙腈作为有机相是由于色谱峰的基线平稳和洗脱；选择水相流动相时，加入磷酸，在一定程度上可以调节峰的平滑度和峰形的对称性。由于磷酸具有一定黏度，因此选择柱温为40 ℃、流速为0.8 ml/min，以便溶剂流动相良好。在选择上述参数的情况下，整个系统柱压运行平稳，说明此提取条件可行。

因待测化合物具有不同的最大吸收波长，逐一选择最大吸收波长对后期计算不便，因此综合考虑选择205 nm 为检测波长，各化合物有一定的吸收强度。配制样品时，需考察不同浓度溶剂对提取效果的影响，发现采用70%甲醇作为提取溶剂时，各组分的含量处于一个整体，较其他溶剂（水、乙醇、50%甲醇、70%乙醇等）提取水平高。

本实验测定结果显示，不同批次的6 种成分存在一定的差异，如丹参酮Ⅰ、虎杖苷在不同批次中含量差异波动>50%，可能是由于生产投料时原药材含量质量差异所致，因此在选择原药材时，应规范药材产区，以维持成分含量的平稳。且定量数据经软件处理后，筛查出影响差异的主要因素是栀子苷和西红花苷Ⅰ，为相应评定标准的建立提供参考依据。

另外，本实验保证批次样品间的稳定性，缩小了批次间的差异性，建立了栀子苷和西红花苷Ⅰ的定量标准。本实验应用HPLC 法对肝复颗粒6 种成分含量的测定以及质量控制，对比较不同批次的样品及药效评价提供了一定的数据参考。