益肾调经方调控PI3K/Akt通路对早发性卵巢功能不全大鼠卵巢功能及凋亡蛋白表达的影响

金国钰，杨春润，何静，盖敏雪，张舒荣，刘欢欢，李长忠

（1. 山东中医药大学，山东 济南 250355； 2. 山东省立医院，山东 济南 250021； 3. 山东大学，山东 济南 250012； 4. 济南大学，山东 济南 250024； 5. 江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330025； 6. 北京大学深圳医院，广东 深圳 518036）

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是一种常见的自发性和异质性疾病，指女性40岁之前出现卵巢功能衰退甚至丧失，伴促性腺激素水平升高以及雌激素水平下降［1-3］。随着医疗水平的发展以及就医观念的改变，POI 的发病率逐年增加且呈现出年轻化趋势［4-5］。多数POI 患者在月经不调开始后12～24 个月内卵巢功能迅速下降，随之出现继发性闭经。同时，POI 还会导致骨质疏松症、心血管疾病及情志障碍相关疾病（焦虑、抑郁）等，严重影响广大女性身心健康［6-7］。

目前，POI 相关机制尚未完全明确，遗传缺陷、自身免疫性疾病、医源性因素和环境暴露等因素均能导致POI 的发生［8-9］。 激素替代疗法（hormone replacement therapy，HRT）作为目前最常用的治疗手段［6，10］，虽然能够暂缓POI 带来的一系列症状，但对生殖功能无明显改善，同时长期口服雌/孕激素也会增加静脉血栓、中风、妇科肿瘤等疾病的患病风险［11-12］。

中医学相关文献中尚无POI 的病名记载，可将其归于“闭经”“月经后期”“血枯”“不孕症”等范畴。目前，中医药在调经促孕方面疗效明显，优势突出［13-15］，益肾调经方作为临床经验方，能够有效改善卵巢功能，保护女性生育能力，但其具体作用机制尚不明确。本研究通过腹腔注射环磷酰胺溶液（cyclophosphamide，CTX）构建POI 模型大鼠，探讨益肾调经汤对CTX 诱导POI模型大鼠的影响及可能机制，以期为POI的临床治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

60 只SD 大鼠由山东省立医院动物实验中心提供，雌性，6 周龄，体质量（220 ± 10）g。实验动物饲养于山东省立医院实验动物中心二楼东侧SPF 环境中，室温控制在20～25 ℃，相对湿度40%～60%，实验过程中严格遵守山东省立医院动物伦理委员会规定（山东省立医院动物伦理批号为NO.2020-004）。

1.2 实验药物

戊酸雌二醇片（1 mg/片，拜耳，批号：224A2）；益肾调经方组方熟地黄15 g，当归12 g，醋龟甲10 g，山药20 g，山茱萸12 g，酒苁蓉20 g，醋香附15 g，党参15 g，丹参15 g，黄芪20 g，枸杞子20 g，淫羊藿15 g，菟丝子20 g，由山东省立医院药房提供，益肾调经方生药与颗粒剂等量换算，相当于免煎颗粒43.5 g/剂。

1.3 实验试剂

4%组织细胞固定液、1 × PBS 缓冲液、苏木素伊红染色试剂盒（P1110、P1020、G1120，北京索莱宝科技有限公司）；环磷酰胺试剂（HY-17420，MCE）；大鼠雌二醇（E2）Elisa 试剂盒、大鼠促卵泡生长激素（FSH）试剂盒、大鼠促黄体生成（LH）试剂盒、大鼠抗缪勒管激素（AMH）试剂盒（202206、202207、202207、202207，山东科研云生物科技公司）；兔抗PI3K 单克隆抗体、兔抗Akt 单克隆抗体、兔抗Bcl-2 单克隆抗体、鼠抗Bax 单克隆抗体（20584-1-AP、10176-2-AP、26593-1-AP、50599-2-Ig，武汉三鹰生物技术有限公司）；RNA Isolater、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（017E2250FA、017E2250FA、027E2201CB，南京诺唯赞生物科技有限公司）。

1.4 实验设备

微量电子秤（BS210S，德国Sartorious，）；室温离心机（5430R，德国Eppendorf）；高速低温离心机（5810R，德国Eppendorf）；组织脱水机（Excelsior AS，美国Thermo Scientific）；组织包埋机（Histostar，美国Thermo Scientific）；石蜡切片机（RM2235，德国Laica）；水平脱色摇床（TS-10000，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；全自动酶标仪（Multiskan FC，美国Thermo Scientific）；荧光定量PCR仪（LightCycler 480 Ⅱ，德国Roche）。

2 方法

2.1 模型建立和分组

SD 大鼠适应性喂养7 d 后，每天固定时间行阴道脱落细胞学检查，连续10 d。将动情周期正常的大鼠纳入实验（n= 60），使用随机数字表随机分为空白组、模型组、对照组和中药低、中、高剂量组，每组10 只。空白组大鼠腹腔注射生理盐水，其余各组大鼠腹腔注射CTX 诱导POI 大鼠模型，首次50 mg/（kg·d），然后按8 mg/（kg·d）剂量连续给药14 d。建模成功后，对照组给予0.1 mg/（kg·d）戊酸雌二醇；中药各剂量组给予5 mL/（kg·d）的益肾调经汤中药溶液；空白组与模型组给予同等体积的生理盐水，连续灌胃14 d。

参照《药理实验方法学》：200 g 大鼠的用药剂量 =人临床日用量 × 0.018 × 5。换算各组大鼠给药浓度，结果见表1。

表1 各组给药剂量及浓度

2.2 标本采集

末次给药后，禁食禁水12 h，腹腔注射25 mg/kg 戊巴比妥溶液用于麻醉大鼠，电动剃毛器备皮，1%碘酊消毒，腹部行Y型切口，充分暴露腹主动脉。使用一次性真空釆血管采血，室温静置45 min，离心15 min（离心条件：温度4 ℃，1 500 r/min），上层淡黄色血清分装于冻存管中，放于-80 ℃冰箱冻存备用。游离双侧卵巢、尽可能去除多余脂肪组织，称重，一侧卵巢放入液氮冻存，另一侧卵巢4%的多聚甲醛固定。

2.3 检测指标

2.3.1 一般情况

从给药第2 天开始，每天固定时间观察并记录大鼠的一般情况（体质量、行为活动、饮食、二便情况）。

2.3.2 动情周期变化

从给药第2 天开始，每天固定时间进行阴道脱落细胞涂片检查，连续14 d。

2.3.3 卵巢指数

游离双侧卵巢、尽可能去除多余脂肪组织，称重并记录，计算卵巢指数。

卵巢指数 = 卵巢湿重（mg）/体质量（g）

2.3.4 HE染色观察卵巢组织形态改变组织切片常规脱蜡至水，苏木素染色，1%盐酸乙醇分化，伊红染色，常规脱水、透明，中性树胶封片。

2.3.5 ELISA法检测血清激素水平

取大鼠血清，按照试剂盒说明书操作，检测血清中E2、FSH、LH、AMH 含量，用标准品的浓度和OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，算出各样品的浓度。

2.3.6 RT-qPCR 检测大鼠卵巢组织PI3K、Akt、Bcl-2及Bax表达

取部分卵巢组织，按照试剂盒说明书步骤操作，检测PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA 表达情况，以2-ΔΔCT法进行相对定量分析。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，引物序列见表2。

表2 引物序列表

2.3.7 免疫组织化学法检测大鼠卵巢组织PI3K、Akt、Bcl-2及Bax表达情况

组织切片脱蜡至水，Tris-EDT 修复液抗原修复，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，5% BSA 封闭非特异性靶点，分别加入稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温，滴加适量即用型HRP 标记抗兔二抗，DAB 显色，滴加适量1% CuSO4增强信号，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树胶封片。空白组滴加PBS代替一抗，其余步骤同前。

2.4 统计学方法

釆用SPSS25软件进行统计学分析，本研究所使用数据均为计量数据，釆用均数 ± 标准差（±s）表示，多组数据间比较釆用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两数据间比较釆用LSD-t分析。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况比较

空白组大鼠精神状态良好，行为活动正常，饮食及二便均正常。与空白组比较，模型组大鼠精神状态差，活动量减少，喜聚堆蜷卧，进食减少，部分大鼠出现脱毛。给予对应药物治疗后，上述症状出现不同程度改善，其中药高剂量组、对照组效果最为明显。

与空白组比较，模型组大鼠体质量明显下降（P＜ 0.000 1）；与模型组比较，给予治疗药物7 d后，对照组、中药中剂量组及中药高剂量组大鼠体质量明显增长（P＜ 0.000 1），给予治疗药物14 d 后，各给药组大鼠体质量均有所增长（P＜ 0.05）。其中，对照组及中药高剂量组改善效果最为明显，接近于空白组，且两组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表3。

表3 各组大鼠不同时间点体质量变化情况比较（±s，g）

表3 各组大鼠不同时间点体质量变化情况比较（±s，g）

注：与空白组比较，####P ＜ 0.000 1；与模型组比较，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；与对照组比较，△P ＜ 0.05，△△△△P ＜ 0.000 1。

第14天259.00 ± 1.53 224.70 ± 0.67####252.30 ± 1.76****215.70 ± 3.28*△△△△242.30 ± 0.88***△255.00 ± 1.73****组别空白组模型组对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 10第1天222.00 ± 1.52 223.70 ± 2.84 223.00 ± 2.30 219.30 ± 1.86 223.00 ± 2.30 222.70 ± 0.89第7天243.70 ± 2.03 210.30 ± 0.89####241.00 ± 1.16****210.30 ± 1.45△△△△233.70 ± 2.33****△245.70 ± 0.67****

3.2 各组大鼠动情周期变化情况比较

与空白组比较，模型组大鼠动情周期明显延长（P＜ 0.000 1）；与模型组比较，各给药组大鼠动情周期明显缩短（P＜ 0.000 1）。见表4。

表4 各组大鼠动情周期变化情况比较（±s）

表4 各组大鼠动情周期变化情况比较（±s）

注：与空白组比较，####P ＜ 0.000 1；与模型组比较，****P ＜ 0.000 1；与对照组比较，△P ＜ 0.05。

动情周期/h 113.30 ± 1.48 298.80 ± 8.53####133.80 ± 1.38****101.4 ± 4.20****△114.20 ± 1.16****137.20 ± 1.86****组别空白组模型组对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 10

3.3 各组大鼠卵巢指数情况比较

与空白组比较，模型组卵巢指数明显下降（P＜0.000 1）；与模型组比较，对照组、中药高剂量组卵巢指数明显升高（P＜ 0.000 1），两组间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见表5。

表5 各组大鼠卵巢指数情况比较（±s）

表5 各组大鼠卵巢指数情况比较（±s）

注：与空白组比较，####P ＜ 0.000 1；与模型组比较，****P ＜ 0.000 1；与对照组比较，△△△△P ＜ 0.000 1。

卵巢指数/%0.91 ± 0.08 0.37 ± 0.08####0.80 ± 0.06****0.28 ± 0.01△△△△0.37 ± 0.04△△△△0.80 ± 0.03****组别空白组模型组对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 10

3.4 各组大鼠卵巢组织形态学观察

空白组卵巢组织皮质及髓质结构清晰完整，可见各级卵泡（始基、初级、次级卵泡和窦前卵泡等）及黄体，间质内血管丰富、未见淋巴细胞浸润及纤维化。模型组卵巢组织结构紊乱，卵巢髓质萎缩，皮质增生并出现纤维化样改变，各级卵泡数量减少（始基卵泡、初级卵泡最为明显），闭锁卵泡数量增加。

给予相应药物后，中药低剂量组无明显改善，可见成熟卵泡，但整体数量较少；中药中剂量组优势卵泡数目明显增加，闭锁卵泡减少；对照组、中药高剂量组卵巢组织结构清晰，各级卵泡数量较模型组、中药低剂量组明显增加，卵泡充盈，与空白组接近。见图1。

图1 卵巢组织病理切片图（ × 200）

3.5 各组大鼠血清性激素水平比较

与空白组比较，模型组E2、AMH 水平下降（P＜0.001，P＜ 0.000 1）、FSH、LH水平升高（P＜ 0.000 1）；与模型组比较，各给药组E2水平升高（P＜ 0.000 1）、FSH、LH 水平降低（P＜ 0.01，P＜ 0.001，P＜0.000 1），对照组、中药高剂量组AMH 水平升高（P＜ 0.01）；其中，中药中剂量组、中药高剂量组E2水平明显高于对照组（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。见表6。

表6 各组大鼠血清性激素水平比较（±s）

表6 各组大鼠血清性激素水平比较（±s）

注：与空白组比较，###P ＜ 0.001，####P ＜ 0.000 1；与模型组比较，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；与对照组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001，△△△△P ＜ 0.000 1。

AMH/（pg/mL）200.1 ± 1.94 152.8 ± 4.89###183.8 ± 1.92**152.5 ± 1.69△△157.7 ± 2.85△182.1 ± 9.07**组别空白组模型组对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 10 E2/（ng/L）82.19 ± 1.06 36.45 ± 0.41####62.84 ± 0.53****61.31 ± 2.00****70.48 ± 0.48****△△77.82 ± 0.58****△△△△FSH/（IU/L）20.06 ± 1.23 34.80 ± 1.56####17.79 ± 1.16****24.40 ± 1.21**△23.70 ± 1.35***17.58 ± 1.22****LH/（ng/L）22.66 ± 1.18 33.37 ± 0.77####21.61 ± 0.39****28.10 ± 0.48**△△△19.08 ± 0.30****21.01 ± 0.71****

3.6 各组大鼠卵巢组织PI3K、Akt、Bcl-2 及Bax mRNA表达比较

与空白组比较，模型组PI3K mRNA、Akt mRNA及Bcl-2 mRNA 表达明显降低（P＜ 0.001，P＜0.000 1），Bax mRNA 表达明显升高（P＜ 0.000 1）；与模型组比较，对照组、中药高剂量组Akt mRNA 表达升高（P＜ 0.01，P＜ 0.001）；对照组、中药中剂量组及中药高剂量组PI3K mRNA、Bcl-2 mRNA 表达升高（P＜ 0.05，P＜ 0.001，P＜ 0.000 1），Bax mRNA表达逐渐降低（P＜ 0.01，P＜ 0.000 1）；其中中药高剂量组Bax 蛋白表达低于对照组（P＜ 0.05）。见表7。

表7 各组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA表达情况比较（±s）

表7 各组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax mRNA表达情况比较（±s）

注：与空白组比较，###P ＜ 0.001，####P ＜ 0.000 1；与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；与对照组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001。

Bax 0.44 ± 0.04 1.00 ± 0.03####0.71 ± 0.04**0.90 ± 0.07 0.58 ± 0.05***0.46 ± 0.02****△组别空白组模型组对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 10 PI3K 4.17 ± 0.21 1.00 ± 0.08####3.08 ± 0.27****1.67 ± 0.12△△△2.86 ± 0.04****3.58 ± 0.08****Akt 4.21 ± 0.35 1.00 ± 0.08####2.32 ± 0.20**1.48 ± 0.03 1.79 ± 0.07 2.83 ± 0.20***Bcl-2 3.17 ± 0.13 1.01 ± 0.10###2.16 ± 0.19*0.79 ± 0.06△△2.53 ± 0.23**2.91 ± 0.38***

3.7 各组大鼠卵巢组织PI3K、Akt、Bcl-2 及Bax 蛋白表达比较

与空白组比较，模型组PI3K、Akt 及Bcl-2 蛋白表达明显降低（P＜ 0.000 1），Bax 蛋白表达明显升高（P＜ 0.000 1）；与模型组比较，各给药组PI3K、Akt 及Bcl-2 蛋白表达升高（P＜ 0.05，P＜0.01，P＜ 0.001，P＜ 0.000 1），对照组、中药中剂量组及中药高剂量组Bax 蛋白表达降低（P＜0.000 1）；

其中，中药高剂量组PI3K、Akt 蛋白表达高于对照组（P＜ 0.000 1）；Bax 蛋白表达低于对照组（P＜0.05）。见图2～5和表8。

图2 各组大鼠卵巢组织中PI3K表达图（ × 200）

图3 各组大鼠卵巢组织中Akt表达图（ × 200）

图4 各组大鼠卵巢组织中Bcl-2表达图（ × 200）

图5 各组大鼠卵巢组织中Bax表达图（ × 200）

表8 各组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax 蛋白表达情况比较（±s）

表8 各组大鼠卵巢组织中PI3K、Akt、Bcl-2及Bax 蛋白表达情况比较（±s）

注：与空白组比较，####P ＜ 0.000 1；与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1；与对照组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01，△△△P ＜ 0.001，△△△△P ＜ 0.000 1。

Bax 0.12 ± 0.00 0.19 ± 0.00####0.15 ± 0.00****0.19 ± 0.00△△△△0.13 ± 0.00****△△0.13 ± 0.00****△组别空白组模型组对照组中药低剂量组中药中剂量组中药高剂量组n 10 10 10 10 10 10 PI3K 0.17 ± 0.00 0.06 ± 0.01####0.10 ± 0.00****0.08 ± 0.00***△△0.08 ± 0.00**△△△0.16 ± 0.00****△△△△Akt 0.14 ± 0.00 0.07 ± 0.00####0.10 ± 0.00****0.09 ± 0.00***0.10 ± 0.00****0.13 ± 0.00****△△△△Bcl-2 0.18 ± 0.00 0.11 ± 0.00####0.16 ± 0.00****0.12 ± 0.00*△△△△0.15 ± 0.00****0.15 ± 0.00****

4 讨论

卵巢颗粒细胞是修复卵巢功能的关键，在FSH 和LH的共同作用下，卵巢颗粒细胞可以合成甾体激素雌激素和孕酮，在卵泡发育过程中发挥着重要作用。卵巢颗粒细胞功能受损时，不仅性激素生成受到影响，还能进一步影响卵泡的发育，进而导致不同发育阶段卵泡闭锁发生［16-17］。卵巢颗粒细胞自噬、凋亡等异常是导致卵泡细胞过早过快闭锁的原因之一，其发生与相关信号通路及基因密切相关，其中，最经典的是通过PI3K/Akt信号通路影响Bcl-2、Bax等［18-19］。

PI3K/Akt 信号通路负责许多细胞行为,包括生存、生长和增殖。研究显示，PI3K/Akt 通路广泛参与卵巢颗粒细胞增殖、凋亡等过程，上调PI3K/AKT 表达能够抑制卵巢组织损伤，以恢复卵巢功能［20-22］。凋亡是一种细胞程序性死亡方式，发生在细胞发育的各个阶段。卵泡内细胞异常凋亡与卵泡闭锁密切相关，可导致卵巢功能的衰竭，是卵巢功能低下的主要发生机制。触发凋亡有两种途径，分别是线粒体途径（内在途径）和死亡受体途径（外在途径）。Bax 和Bcl-2 同属于Bcl-2家族，在线粒体细胞凋亡途径中起关键作用，并且已被证明可以调节卵巢凋亡。研究显示益肾填精类中药可以增加POI 大鼠卵巢的Bcl-2 蛋白表达，降低Bax 蛋白的表达，减少颗粒细胞凋亡，增加颗粒细胞分泌［23-25］。

肾为先天之本，藏精，主生殖，若肾精亏虚，则冲任失调，无血以下；肝肾精血互生、藏泄互用，若肝失濡养，疏泄失司，则气机阻滞，气血运行失常；脾主统血，脾主运化，若脾胃损伤，气血不足，则化经无源，血海失养。因此，肝、脾、肾功能正常，方能冲任调达，生化有源。

益肾调经方是由左归丸演变而来，方中熟地黄、淫羊藿、枸杞子为君，滋阴补血、益精填髓、温肾壮阳，阴阳并补；臣以山茱萸、山药、菟丝子平补肝肾之良药，阴阳并治，阴平阳秘，使冲任调达，月经如时以下；佐以肉苁蓉、醋龟甲滋阴潜阳、益肾安神；当归、丹参养血活血、调经止痛；党参、黄芪补气健脾；醋香附行气疏肝、活血止痛。全方虚实并治，补肾为主，兼顾肝脾，同时辅以行气、活血、补血之法，以达阴阳平衡，冲任调摄，月经复常。

因此，本实验基于PI3K/Akt 通路及凋亡相关蛋白探讨益肾调经方治疗POI 的作用机制。实验结果显示，益肾调经方能够有效改善CTX 诱导的POI 模型大鼠的一般状况，调节动情周期和血清激素紊乱，同时上调PI3K、Akt mRNA 及蛋白的表达，从而促进卵巢颗粒细胞增殖，原始卵泡的发育。此外，益肾调经汤还能增强Bcl-2 的表达及抑制Bax 的表达，从而抑制大鼠卵巢颗粒细胞过度凋亡。其中，高剂量组效果最佳，与对照组（戊酸雌二醇）效果最为接近，甚至部分指标优于对照组。综上，益肾调经汤对POI 的治疗作用可能是通过调控PI3K/Akt信号通路及凋亡相关蛋白实现。