基于网络药理学和动物实验探究利咽方治疗慢性咽炎的机制

曹雅岚，李淑坤，黄一平，顾晓娜，张鹏✉

（1. 南京中医药大学附属中西医结合医院，江苏 南京 210023； 2. 江苏省中西医结合医院，江苏 南京 210028）

慢性咽炎（chronic pharyngitis，CP）是咽部黏膜、黏膜下组织和淋巴样组织的慢性炎症［1-2］，临床表现为咽喉痒、干、痛，咳嗽，有异物感以及喉部梗阻［3-4］。中国CP患者占耳鼻喉科门诊就诊患者总数的1/3。CP的发生与环境污染、微生物污染和吸烟等因素相关［5］，研究表明，空气污染物的增加与CP 的发生呈正相关，特别对于15 岁以下的患者［6］。CP 的病因可分为感染性因素和非感染性因素，病毒、细菌和真菌是常见的感染因素，其中化脓性链球菌A 群链球菌（GAS）是儿童和成人细菌性咽炎最常见的病因［7］；长期饮酒和吸烟是常见的非传染性因素［8］。

目前，CP 病理机制尚不清楚，由于反复发病和病程长，CP 患者承受了相当大的身心负担。中医药治疗CP 的方法多种多样，包括煎、茶、汤、针灸、放血和按摩等［9］。现代医学中常用抗生素、气雾剂、扁桃体切除术等治疗方法，但抗生素具有副作用且会增加耐药性，从而加重感染性咽炎。此外，使用抗生素治疗真菌和其他非感染性因素引起的CP是无效的。扁桃体切除术常用于治疗儿童咽炎，但缺乏足够的循证研究证实这种治疗的有效性［5，8，10］。因此，需要更安全、有效、可靠的治疗方法。中医药对CP 具有独特的治疗优势，利咽方（LYF）由半夏厚朴汤发展演变而来，主要由桔梗、厚朴、生姜、茯苓、甘草、青果和紫苏叶等中药组成，具有燥湿消痰、下气除满的功效，对慢性呼吸道疾病症状，如干咳、喘息、喉咙发炎和声音嘶哑等有较好治疗效果。

网络药理学是一门以系统生物学为基础的新兴学科［11］，其利用网络系统生物学，选择特定的信号节点来定义药物分子的多个靶点。中医认为病人是一个整体，不治疗疾病的症状，它采取分析方法，检查病因机制以解释与疾病相关的变化，并提供适当的治疗［1］。正是由于中医和中药化合物的概念与网络药理学的相似性，网络药理学被认为是研究中药有效成分和靶点的重要工具。因此，利用网络药理学探索LYF 治疗CP的关键靶点、分子过程和信号通路，能为LYF 临床治疗CP提供参考。

1 材料及试剂

1.1 实验动物

SD 大鼠由江苏省中医药研究院动物中心提供，48 只，SPF 级，体质量180～220 g，雌雄各半，动物许可证号：SYXK（苏）2021 - 0025，饲养于温度18～25 ℃，湿度为40%～60%的洁净环境，饮用无菌水，食用常规饲料，12 h 昼夜交替照明。实验动物所有操作均符合江苏省动物伦理委员会标准，伦理编号：AEWC -20220323 - 196。

1.2 实验药品、材料及试剂

利咽方处方药液采用相应中药提取物按处方比例混匀后水溶的方法配制，中药提取物为：桔梗提取物C100402 - 01、紫苏叶提取物C121101 - 01、青果提取物C082202 - 02、甘草提取物C050501 - 05、茯苓提取物C090401 - 05、厚朴提取物C092101 - 02、生姜提取物C050603 - 10（广东青云山药业有限公司，批号：20210301、20210901、20211201Z、20211102、20210901、20220301Z、20220301Z）；无蔗糖型慢严舒柠清喉利咽颗粒（桂龙药业安徽有限公司，批号：2110051）；氨水（南京化学试剂股份有限公司，批号：20200108）；TNF - α、IL - 1β 和IL - 6ELISA 试剂盒（中国武汉Elabscience 公司，批号：EL - R2856c、EL - R0015c、EL - R0012c）；抗体GAPDH（Proteintech 公司，货号：10494 - 1 - AP）；TLR4（Proteintech 公司，货号：66350 - 1 - Ig）；IκBα（CST公司，货号：4812）；p - IκBα（CST 公司，货号：2859）；NF - κB（CST 公司，货号：8242）；p - NF - κB（CST 公司，货号：3033）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（CST 公司，货号：7074）；ECL 发光液（上海碧云天生物科技有限公司，货号：P0018AS）。

1.3 实验仪器

倒置光学显微镜（日本奥林巴斯有限公司，型号：Ⅸ - 73）；电子天平（苏测电子科技有限公司，型号：BY - 101）；微型垂直电泳槽（上海天能生命科学有限公司，型号：Tanon VE - 180）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能生命科学有限公司，型号：Tanon 5200）。

2 方法

2.1 筛选利咽方中的有效成分及作用靶点

在TCMSP 数据库中收集LYF 中厚朴、紫苏、茯苓、生姜、桔梗、青果和甘草等药的所有化学成分，以口服利用度（OB） ≥ 30%和类药性（DL） ≥ 0.18 作为条件筛选主要有效成分并收集其靶点，并在Uniprot 数据库中将收集的靶点名称校正为其官方名称。

2.2 筛选慢性咽炎的靶点

通过GeneCards 人类基因数据库获得慢性咽炎相关靶点，筛选相关性得分（Relevance score） ≥ 0.8 的相关靶点，作为疾病靶点。

2.3 构建和分析利咽方治疗慢性咽炎的网络关系

将“2.1”项下获得的药物靶点与“2.2”项下获得的疾病靶点输入Venny网站获得交集靶点，将交集靶点导入STRING数据库，设置种类为“homo sapiens”，置信度蛋白参数评分 ≥ 0.9，隐藏孤立靶点后，下载TSV格式的蛋白互作关系文件并导入Cytoscape软件，以构建蛋白靶点互作（PPI）关系网，然后利用软件中的Cytohabba插件对PPI网络拓扑学分析得到MCC值排名前10的靶点。

冠心病的发生还可能与患者的体内雌激素水平[7]、体内的瘦素水平[8]、胰岛素抵抗[9]、精神心理状态[10-11]等多种因素有关。

2.4 对交集靶点进行GO分析和KEGG富集分析

将上述得到的交集靶点导入Metascepa数据库，设置阈值P＜ 0.01、minimum count = 3、enrichment factor ＞ 1.5等参数，经GO注释分析分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）和细胞组分（cellular component，CC）和KEGG通路分析后再将结果在Cytoscape中进行可视化。

2.5 慢性咽炎动物模型实验

2.5.1 分组、造模及给药

48 只SPF 级SD 大鼠经适应性饲养1 周后依据随机数字表随机分为空白组（Control 组）、模型组（Model组）、利咽方低剂量组（LYF - L 组）、利咽方中剂量组（LYF - M 组）、利咽方高剂量组（LYF - H 组）、阳性药组（MYSN组），每组8只（雌雄各半）。在旋转象鼻喷雾瓶中装入新配制的浓度为2.5%的氨水［12］，除空白组外，其余各组大鼠用氨水喷咽，连续喷20 d，每天喷一次，每次喷2揿；空白组大鼠用无菌水喷咽部。

按照阳性药说明书，MYSN组给药0.97 g/kg。根据LYF 的日剂量，LYF - L 组给药剂量为2.484 g/kg，LYF - M组给药剂量为12.42 g/kg，LYL - H组给药剂量为24.84 g/kg。LYF - L组剂量组药液制备：精密称取提取物粉末（厚朴0.15 g、生姜0.625 g、茯苓0.25 g、桔梗0.75 g、甘草0.35 g、青果0.625 g、紫苏叶0.85 g）共3.6 g，混匀后溶解于25.6 mL纯化水中，制得0.14 g提取物/mL的利咽方药液，用于实验动物给药。LYF - H和LYF - M组药液制备：精密称取提取物粉末（厚朴0.6 g、生姜2.5 g、茯苓1.0 g、桔梗3.0 g、甘草1.4 g、青果2.5 g、紫苏叶3.4 g）共14.4 g，混匀后溶解于17.4 mL纯化水中，制得0.83 g提取物/mL的利咽方药液，用于实验动物给药。

各给药组每天灌胃1 次，连续给药14 d，模型组每天给予等量无菌水。给药结束后，取眼眶静脉丛血，切除咽黏膜组织。咽部黏膜组织一部分用4%多聚甲醛固定，另外一部分 - 80 ℃冷冻待测。

2.5.2 检测指标

2.5.2.1 ELISA检测

血液样品在室温（25 ℃）静止2 h 后，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清，然后严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清TNF - α、IL - 6和IL - 1β水平。

2.5.2.2 HE染色

大鼠的咽部组织浸泡在固定液（4%甲醛水溶液）中24 h，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱水，包蜡，切片，染色，得到大鼠咽部的切片，然后在光学显微镜下进行观察。

2.5.2.3 Western blot检测

提取咽部组织的蛋白，然后制备10%分离胶和5%浓缩胶，上样，电泳，转膜，然后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗（GAPDH、TLR4、IκBα、p - IκBα、NF - κB、p - NF - κB），抗体与封闭液配制比例分别为1∶1 000，4 ℃过夜，TBST 洗膜 3 次，每次10 min；次日洗膜后加入二抗（辣根酶标记山羊抗兔，与封闭液配制比例1∶3 000），室温孵育1 h，TBST 洗膜 3 次，每次15 min，使用增强化学发光免疫印迹对目的条带进行图像采集，采用ImageJ 1.53 软件对条带进行分析。

2.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2. 软件对所有实验数据进行统计分析，实验结果以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 LYF中的有效成分与作用靶点收集

在TCMSP 数据库中得到有效成分141 个，收集并筛选有效靶点205 个。图中蓝色圆圈代表药物成分，橙色方块代表药物靶点，药味 - 成分 - 靶点网络图中330节点和1 426条边。见图1。

图1 利咽方药物 - 靶点

3.2 交集靶点的蛋白相互作用（PPI）及分析

通过GeneCards 数据库一共收集到符合筛选条件的疾病靶点1 950个，将LYF的潜在靶点和CP相关靶点基因取交集，共获得112个重叠靶点，在Venny网站对数据进行形象化处理，结果见图2。将上述112个交集靶点导入String 网站获得交集靶点的PPI 文件并在Cytoscape中将其可视化，以度值大小调节节点大小和颜色深浅，获得交集靶点的PPI图，见图3。根据MCC值大小筛选出排名前10的蛋白，颜色越深表明蛋白越重要，其中以IL - 6、TNF和IL - 1β蛋白的颜色较深，见图4。

图2 交集靶点Venny图

图3 交集靶点PPI图

图4 MCC值排名前10的蛋白图

3.3 KEGG通路分析和GO富集分析

对交集靶点进行GO功能富集分析，选取P值排名靠前的10个结果进行展示，见图5。结果表明，利咽方的治疗途径的生物过程主要涉及无机物反应、对异种刺激的反应及对脂多糖的反应等方面；细胞组分主要涉及膜筏、细胞器外膜、囊腔等位置；分子功能主要涉及细胞因子受体结合、DNA 转录因子结合及泛素样蛋白连接酶结合等功能。而KEGG 结果表示LYF可能通过癌症、脂质和动脉粥样硬化及乙型肝炎等相关通路发挥作用，见图6。

图5 GO分析结果图

图6 KEGG气泡图

3.4 血清TNF - α、IL - 1β、IL - 6水平

与Control 组比较，Model 组血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平明显升高差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与Model 组比较，各治疗组（MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H组）血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平明显降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05），且与LYF的剂量呈负相关。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平比较（±s，pg/mL）

表1 各组大鼠血清TNF - α、IL - 6、IL - 1β水平比较（±s，pg/mL）

注：与Control组比较，#P ＜ 0.05；与Model组比较，*P ＜ 0.05。

IL - 1β 101.54 ± 8.18 186.51 ± 5.37#117.63 ± 5.63*162.99 ± 4.24*144.10 ± 6.49*113.75 ± 7.89*组别Control组Model组MYSN组LYF - L组LYF - M组LYF - H组n6 6 6 6 6 6 TNF - α 61.09 ± 4.33 145.18 ± 5.63#72.09 ± 6.39*129.33 ± 7.06*99.02 ± 6.33*73.20 ± 4.88*IL - 6 73.86 ± 4.26 145.44 ± 6.33#93.29 ± 6.79*131.56 ± 3.02*101.36 ± 6.24*86.11 ± 5.00*

3.5 组织病理学结果

Control 组上皮未见坏死和脱落，固有层含有大量紧密结缔组织，炎症细胞浸润极少；Model 组黏膜下层结缔组织疏松，含有各种结构异常、增生的混合腺体，这些腺体突破固有层，破坏喉咽黏膜，炎症细胞的根尖浸润明显，符合CP 的病理特征。各治疗组切片显示黏膜上皮角质化、部分坏死和脱落，发生层增生细胞数量较多，炎性细胞持续浸润，与Model 组比较，咽黏膜恢复增强，炎症减轻。见图7。

图7 大鼠咽部组织HE切片图（ × 200）

3.6 Western blot 检测组织蛋白TLR4、pI - κBα、I -κBα、NF - κB的表达

与Model 组比较，MYSN 组和LYF - H 组TLR4 蛋白表达降低，MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H 组I -κBα 蛋白表达下降，pI - κBα 蛋白MYSN、LYF - H 和LYF - M 组表达下降，且MYSN、LYF - L、LYF - M、LYF - H 组中磷酸化NF - κBp65 蛋白与p65 蛋白的比值与模型组相比也下降。具体结果见表2和图8。

表2 各组大鼠咽部组织中蛋白TLR4、pI - κB α、I - κB α、NF - κB的表达（±s）

表2 各组大鼠咽部组织中蛋白TLR4、pI - κB α、I - κB α、NF - κB的表达（±s）

注：与Control组比较，#P ＜ 0.05；与Model组比较，*P ＜ 0.05。

NF - κB 0.62 ± 0.02 1.31 ± 0.09#0.77 ± 0.07*1.13 ± 0.04*0.93 ± 0.06*0.90 ± 0.01*组别Control组Model组MYSN组LYF - L组LYF - M组LYF - H组TLR4 0.22 ± 0.04 0.69 ± 0.03#0.34 ± 0.07*0.62 ± 0.09 0.52 ± 0.08 0.44 ± 0.06*I - κBα 0.88 ± 0.02 0.26 ± 0.08#0.70 ± 0.05*0.46 ± 0.03*0.53 ± 0.02*0.67 ± 0.02*pI - κBα 0.13 ± 0.01 0.72 ± 0.18#0.27 ± 0.06*0.56 ± 0.10 0.45 ± 0.09*0.29 ± 0.08*

4 讨论

通过网络药理学研究，从LYF中鉴定出205个活性化合物，这些成分已被证明在免疫和炎症中具有调节作用。例如，厚朴中的酚类化合物可以抑制NF - κB通路中I - κBα 和p65的磷酸化，从而抑制炎症反应［13-15］。青果可抑制炎症细胞因子IL - 1β 和TNF - α 的表达［16-17］。此外，LYF 中其他化学成分，如紫苏中的挥发油成分［18-20］，姜中的姜辣素［21-23］和桔梗中的桔梗皂苷D［24-25］可以调节细胞和体液免疫以及肠道免疫反应，具有增强免疫力的作用；茯苓中的三萜和多糖［26-28］以及甘草中的甘草酸［29-32］不仅可以增强免疫力，还可以通过抑制炎症细胞因子的表达和产生起到抗炎作用。通过对交集靶点PPI 网络进行拓扑分析得到了较为重要的靶点为IL - 6、TNF、IL - β，而动物实验证明了LYF能够降低大鼠血清中TNF - α、IL - 6、IL - 1β 水平，且与LYF剂量呈正相关。综上所述，LYF治疗慢性咽炎可能通过调节TNF、IL - 6、IL - 1β等因子发挥抗炎作用。

KEGG 通路分析结果显示，LYF 治疗CP 的作用机制可能与抑制NF - κB 通路有关。核因子 - κB（NF -κB）转录因子家族在调节免疫发育、免疫反应、炎症和癌症中发挥着重要作用［33］。NF - κB 家族［34］包括NF -κB1 p50、NF - κB2 p52、RELA（也称为p65）、RELB 和c - REL，它们通过典型和非典型NF - κB 信号通路发生。前者主要由NF - κB1 p50、RELA和c - REL介导，后者主要激活p100 隔离的NF - κB 成员，主要是NF -κB2 p52 和RELB（也称为非典型NF - κB 家族成员）。在静息状态下［35］，NF - κB 与κB 抑制剂（I - κB）结合，如主要受I - κBα 调控的典型p50/p65 异源二聚体，一旦受到刺激，I - κB 被磷酸化降解，释放的NF - κB 进入细胞核诱导基因表达，最终导致炎症。动物实验用Western blot 测定大鼠咽部组织中蛋白TLR4、I - κBα、NF - κBp65的表达，结果显示，LYF治疗后的大鼠咽部组织中磷酸化I - κBα蛋白水平低于模型组，且呈剂量依赖性，p65/p65 蛋白比例低于模型组，说明LYF 能够抑制p65蛋白的磷酸化，从而抑制炎症的发生。

此外，笔者发现高剂量LYF 组可以抑制Toll 样受体4（TLR4）蛋白的表达。TLR4 属于模式识别受体（PRR）家族，是先天免疫系统的关键组成部分［36］。当受到细菌脂多糖以及病理条件下产生的其他病原体衍生成分或内源性分子的刺激时，TLR4可触发两种主要的信号级联反应；其中包括髓样分化因子88（MyD88）依赖级联，以及Toll/白细胞介素1 受体域诱导的干扰素β（TRIF）依赖级联［37］。MyD88依赖通路始于细胞质TIR结构域，MyD88激活触发IL - 1受体相关激酶（IRAK），即IRAK1 和IRAK4 的自磷酸化，并进一步与肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）相互作用［38］。IRAK 和TRAF6 的激活最终导致I - κBα 的磷酸化和降解［39-40］。在本研究中LYF - H 组大鼠咽部组织中TLR4 的表达下降，说明此剂量下的LYF 能够抑制TLR4 蛋白的表达。因此，LYF 治疗CP 的效果还可能与抑制TLR4启动的免疫反应有关。

综上所述，本研究运用网络药理学方法，揭示了LYF 通过的多组分、多靶点、多途径治疗CP 的潜在机制。动物实验结果表明，LYF 可以降低血清中TNF -α、IL - 6、IL - 1β 水平，抑制咽部组织中TLR4 表达和NF - κB活化。LYF对CP的治疗作用可能是通过抑制TLR4/NF - κB 通路和下调炎性细胞因子水平，从而抑制炎症反应发生，本研究成果可为今后LYF 的临床应用提供实验依据。