基于转录组学探讨益肾清利活血方对马兜铃酸Ⅰ诱导肾损伤的作用机制

赵思，何伟明，张傲雪，温开智，顾丽娜，贺怡宁

（1. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210023；2. 南京中医药大学附属医院，江苏省中医院，江苏 南京 210029）

慢性肾脏病（chronic kidney disease， CKD）指不可逆的结构或功能性肾损伤，随着高血压、糖尿病及老龄化人口的增多，其全球发病率迅速上升，已成为最受关注的健康问题之一［1-2］。CKD 以进行性肾脏炎症和纤维化为主要特征，炎症参与发生及发展全过程，间质炎症会导致细胞外基质（ECM）沉积和胶原蛋白生成，最终导致纤维化，而持续的纤维化会破坏组织结构和器官功能，最终导致肾衰竭［3-4］。目前CKD的治疗方法主要是干预其发展和并发症，发展至终末期需采取透析或移植措施［2］，考虑到经济压力、不良反应和激素依赖等问题，从疾病早期使用有效安全的方法来延缓CKD进展非常重要。

益肾清利活血方是在邹燕勤国医大师提出“肾虚湿瘀”为基本病机指导下，形成的临床有效经验方，由黄芪、丹参、黄蜀葵花和甘草组成。课题组前期研究表明，黄芪甲苷能显著抑制Wnt/β-catenin 蛋白通路从而拮抗腹膜间皮细胞纤维化能［5］。黄蜀葵花提取物可以调节TGF-β1/Smad7 通路拮抗肾纤维化［6-7］。黄蜀葵花的主要成分金丝桃苷可以通过抑制AMPKULK1 介导的自噬来减轻肾脏损伤［8］。丹参酮ⅡA 具有明显的抗氧化、抗肾纤维化作用。甘草次酸抑制间隙连接，通过调控TXNIP-AKT、JNK、Thioredoxin 等，发挥抗氧化作用［9］。

转录组学具有全面检测、综合分析的特点，与中药复方的治疗特点相符合，在复方药效物质基础上得到了广泛的运用［10］。马兜铃酸肾病是一种快速进展的肾小管间质纤维化，诱发的肾脏疾病的机制包括氧化应激、细胞凋亡和炎症反应等［11］。课题组前期研究表明，马兜铃酸Ⅰ可诱导肾小管上皮细胞损伤［12］。因此，本研究采用马兜铃酸Ⅰ（AAⅠ）诱导的小鼠模型分析益肾清利活血小复方（YSQLHX）治疗后肾脏的转录组谱，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

益肾清利活血方组方：黄芪30 g，黄蜀葵花15 g，丹参20 g 和甘草6 g。制备方法：组方分别加10、8 倍水，连续回流提纯两次，浓缩后冷冻干燥，最终得率为13.3%。马兜铃酸AAⅠ（纯度98%，成都植标化纯生物技术有限公司，批号：PCS-190415）。

1.2 动物

雄性7～8 周龄C57BL/6 小鼠，由南京青龙山动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（浙）2019-0002，实验已获得南京中医药大学实验动物伦理委员会批准（审批号：012071001432），饲养于SPF 级实验室，室温18～22 ℃，相对湿度45%～70%，自由摄食饮水，12 h昼夜节律。

1.3 试剂

血清肌酐（Scr）、尿酸（UA）、尿蛋白（Pro）定量测试盒（南京建成生物，批号：C011-2-1、C012-2-1、C035-2-1）；艾科瑞RNA 提取试剂盒（湖南艾科瑞生物有限公司，批号：A4A1520）；翌圣逆转录和Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox Plus）试剂盒（翌圣生物科技有限公司，批号：H8216980）。

1.4 仪器

多功能酶标仪（ 美国 Thermo，型号：MULTISKANFC）；光学显微镜（日本Olympus 公司，型号：BX53P）；低温高速离心机（美国Thermo 公司，型号：Fresc017）；安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技公司，型号：G2939B）。

1.5 方法

1.5.1 分组及给药方法

小鼠适应性喂养7 d 后，随机分为正常对照组（Control）、模型组（AAⅠ）、低剂量组（YSQLHX-L）和高剂量组（YSQLHX-H），每组各12 只。具体干预措施如下：①除正常对照组外，其余组小鼠均腹腔注射马兜铃酸Ⅰ 0.1 mL［5 mg/（kg·3d），AAⅠ溶解在0.5%羧甲基纤维素钠中］诱导肾损伤，剂量参考课题组前期研究［12］，共干预30 d；②低剂量组给予益肾清利活血方冻干粉1.463 g/（kg·d），即11 g/（kg·d），高剂量组给予益肾清利活血方冻干粉2.926 g/（kg·d），即22 g/（kg·d），共灌胃30 d；③正常对照组和模型组每天灌胃0.3 mL 含0.5%羧甲基纤维素钠的PBS溶液，共灌胃30 d。

连续给药30 d后，将各组小鼠置于代谢笼内，禁食不禁水，留取各组小鼠尿液。并于6 h后从每组动物眶后窦采集血液，采血后处死各组小鼠，留取各组小鼠肾脏，-80 ℃或液氮保存。

1.5.2 生化指标测定

禁食6 h 后，通过眶后窦收集血液，4 ℃低温离心机以3 000 r/min 离心15 min，分离血清，留取上清液后根据血清肌酐、尿酸、尿蛋白定量测试盒的说明书检测相应指标。

1.5.3 肾脏组织病理学检查

为了评估肾组织中的组织病理学变化，用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤组织三次并固定在4%多聚甲醛中，嵌入石蜡中切成4 μm 切片，并用HE 和Masson 染色，用光学显微镜进行图像采集，每组随机挑选6个染色视野进行统计分析。

1.5.4 RNA制备与转录组

实验结束时，正常对照组、模型组和低剂量组组各取4 个肾组织，根据产品手册说明，使用Tizol（美国加利福尼亚州Invitrogen）从肾组织中提取总RNA，使用安捷伦2 100生物分析仪评估完整性和浓度，然后基于Illumina HiSeq 测序平台进行二代测序获得转录本表达量矩阵。以测序得到的mRNA的原始数据为研究对象，进行FastQC 质量控制，得到Clean Data，参考GRCm39（mm39）基因组序列，通过每千个碱基的转录每百万（TPM）映射来量化每个基因的表达水平。

1.5.5 数据规范化与分析

通过R 软件使用“DESeq2”包分析［12］，计算正常对照组（Control）与模型组（AAⅠ）、模型组（AAⅠ）与低剂量组（YSQLHX-L）之间基因的差异情况，以|log2FC| ＞0.5，Pvalue ＜ 0.05 为阈值筛选显著性差异基因（DEGs），得到名为“diff”的文件为显著的DEGs。使用Metascape 在线平台对差异基因进行GO 功能和KEGG通路富集分析。P＜ 0.05为差异具有统计学意义。

1.5.6 筛选核心靶点

将两组间的DEGs通过Venny在线平台取交集，得到的交集基因导入STRING 数据库中进行分析，再将结果文件导入Cytoscape 中用CytoNCA 插件筛选出DC、BC 和CC 均大于中位数的核心基因，并根据度值从大到小顺序进行作图。

1.5.7 实时荧光定量PCR检测

根据制造商的说明书，使用一步法提取分离总RNA，将总RNA 反向转录为cDNA，用于2 μg 样品，qPCR 以反应体系20 μL 体积进行。采用2-ΔΔCT方法计算，GAPDH 为内参，本实验使用小鼠引物购自上海生工，引物序列见表1，实验重复3次。

表1 引物序列表

1.6 统计学方法

使用Graphpad Prism 8.0.2软件进行分析，采用均数 ± 标准差（±s）进行表示。每份数据进行正态分布检验（以Shaprio-wilk 为准），符合正态分布的数据使用单因素方差分析，样本不符合正态分布时使用非参数检验。P＜ 0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肾功能比较

与正常对照组比较，模型组小鼠的尿酸、尿蛋白与血肌酐水平显著升高，AAⅠ明显损伤小鼠肾功能，与预期结果一致。与模型组比较，低剂量和高剂量组尿酸、血肌酐的水平均显著降低，并以高剂量组效果最好（P＜ 0.001，P＜ 0.000 1）。结果见图1和表2。

图1 各组小鼠肾功能情况比较

表2 各组小鼠肾功能情况比较（±s）

表2 各组小鼠肾功能情况比较（±s）

注：与模型组比较，****P ＜ 0.000 1，***P ＜ 0.001。

组别正常对照组模型组低剂量组高剂量组血肌酐/（μmol/L）18.5 ± 1.7****48.5 ± 5.9 24.6 ± 1.3****19.93 ± 1.9****n6 6 6 6尿酸/（mg/L）59.6 ± 4.5****143.9 ± 13.7 86.3 ± 3.2****71.17 ± 6.8****尿蛋白/（mg/L）257.0 ± 9.1****322.0 ± 13.8 278.2 ± 22.6***225.6 ± 11.5****

2.2 各组小鼠肾脏组织病理情况比较

HE染色显示，正常对照组肾小球及肾小管结构完整、清晰、排列有序、细胞形态完整，未见异常；与正常对照组比较，模型组镜下可见大量的炎症细胞浸润、肾小球萎缩、肾小管管腔扩大、肾小管上皮细胞变性、细胞核外露；而低剂量组和高剂量组肾小管结构较完整，上皮细胞死亡与空泡化减轻，炎症细胞明显减少。Masson 的三色染色可见，模型组肾间质大量胶原纤维沉积，而经益肾清利活血方处理后纤维化面积显著降低。结果见图2和图3。

图3 各组小鼠肾组织Masson染色图（× 400）

2.3 肾脏转录组分析

为了阐明益肾清利活血方对肾脏保护的潜在机制，本实验将正常对照组（Control）、模型组（AAⅠ）、低剂量组（YSQLHX-L）的小鼠肾组织进行转录组测序分析（n= 4）。

2.3.1 差异表达基因分析

通过火山图直观得到，红点标注差异表达上调1 倍以上的mRNA，蓝点标注下调1 倍以上的mRNA，纵坐标代表Pvalue 值，横坐标代表logFC 值，因此离横坐标和纵坐标越远越高代表该基因表达越显著。与正常对照组比较，模型组有2 615 个差异基因，其中有1 409 个上调，1 206 个下调；在低剂量组与模型组中共鉴定出368 个差异基因，其中有180 个上调，188 个下调。结果见图4。

2.3.2 功能富集分析

通过对模型组与低剂量组分析得到的368 个差异基因进行功能富集分析发现，前5 个富集数的分子功能包括氧化还原酶活性、泛素样蛋白连接酶结合、核受体结合、异构酶活性，生物过程有单羧酸代谢过程、激素反应、分泌调节、脂质定位、小分子生物合成，细胞成分有线粒体内膜、脂滴、过氧化物酶体、高密度脂蛋白颗粒、内质网伴侣复合体。KEGG 通路注释显示这些差异基因主要参与PPAR 信号通路，类固醇激素生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，脂肪酸降解，IL-17信号通路等。结果见图5。

图5 模型组与低剂量组差异基因

2.3.3 蛋白互作网络与核心靶点筛选

使用Venny软件分析显示，低剂量组治疗有反应的368个差异基因中有179个与马兜铃酸引起的差异基因重叠，将交集基因导入STRING 数据库中分析，将结果文件导入Cytoscape 中用CytoNCA 插件进行分析，筛选出DC、BC 和CC 均大于中位数的核心基因37 个，并根据度值从大到小排名进行作图。枢纽基因中Ppara、Fabp1、Apoa2、Acox1、Ugt2b34 和Hspa5 都与纤维化密切相关，表明其可能是益肾清利活血方的潜在治疗靶点。结果见图6，前8个核心靶点的拓扑参数见表3。

图6 两组间差异基因的韦恩图及核心靶点PPI图

表3 前8个核心靶点的拓扑参数

2.3.4 核心靶点基因的PCR验证

对前8 个核心基因的小鼠肾脏组织进行qPCR 验证。与正常对照组比较，模型组Ppara、Fabp1、Apoa2、Acox1、Nr1h4 mRNA 水平显著降低，Ugt2b34、Hspa5、Ugt2b5 mRNA 明显升高，而经益肾清利活血方处理后的低、高剂量组调节了AAⅠ诱导的转录本水平的变化。结果见表4和图7。

图7 qPCR检测各组小鼠肾脏组织中的mRNA表达水平

表4 各组小鼠肾脏组织中的mRNA表达水平（±s）

表4 各组小鼠肾脏组织中的mRNA表达水平（±s）

注：模型组比较，****P ＜ 0.000 1，***P ＜ 0.001，**P ＜ 0.01，*P ＜ 0.05，nsP ＞ 0.05。

组别正常对照组模型组低剂量组高剂量组Ppara 1.000 0±0.001 3****0.544 4±0.022 4 1.000 0±0.053 2****1.033 0±0.088 6****Fabp1 1.000 0±0.001 3****0.184 0±0.060 8 0.293 5±0.041 0*0.515 6±0.032 9****Apoa2 1.000 0±0.019 6****0.536 1±0.017 1 1.120 0±0.039 5****0.937 1±0.093 9****Acox1 1.000 0±0.001 3****0.357 4±0.015 4 0.470 0±0.029 7**0.720 6±0.051 0****Nr1h4 1.000 0±0.001 3***0.696 1±0.063 3 0.836 9±0.008 3*1.034 0±0.075 3****组别正常对照组模型组低剂量组高剂量组Ugt2b34 1.000 0±0.001 3****2.453 0±0.142 3 2.082 0±0.131 7**1.926 0±0.110 1**Hspa5 1.000 0±0.012 4****2.290 0±0.354 6 1.330 0±0.074 2***1.196 0±0.027 7***Ugt2b5 1.001 0±0.062 1****2.124 0±0.289 4 2.414 0±0.041 7ns 1.520 0±0.020 0**

3 讨论

中药配方的多组分、多靶点提供了多样化的治疗，通过许多药理活性化合物的协同作用发挥治疗作用。转录组阵列可靠且新颖，可用于搜索具有多种活性成分的中药影响的多个靶点和途径。

本实验研究结果表明，益肾清利活血方可以降低AAⅠ小鼠的尿酸、尿蛋白、血肌酐水平，保护肾功能，显著降低小鼠肾脏的炎症细胞和胶原沉积。通过对小鼠肾脏的mRNA 转录谱分析，可见益肾清利活血方能显著改变生物过程、细胞组分和分子功能的许多基因的转录，特别是炎症反应。KEGG 分析显示益肾清利活血方治疗改变了各种途径，主要参与PPAR 信号通路，类固醇激素生物合成，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，谷胱甘肽代谢，脂肪酸降解，IL-17信号通路等。核心基因中PPARα［13-14］是PPAR 信号通路中的转录因子，Fabp1、Acox1 是该通路中的下游重要靶基因，可调节脂肪酸细胞摄取、运输和代谢，与凋亡、纤维化相关。脂质代谢［15］的改变与各种代谢疾病有关，虽然肾脏没有被归类为代谢器官，但肾小管细胞具有较高的基线能量消耗水平，主要的能量来源是脂肪酸氧化。在肾损伤后，TECs 的脂肪酸氧化能力受损，糖酵解增加，导致活性氧（ROS）以及促炎和促纤维化因子产生增加，并增加TECs凋亡，还可以导致溶酶体功能障碍和自噬增加，加重CKD 进程［15］。HSPA5 可结合并稳定谷胱甘肽过氧化物酶4，铁死亡的发生与GPX4 消耗以及ROS和其他氧化物的产量增加有关［16］。Ugt2b34、Ugt2b5主要在胃肠道、肝脏、肾脏中表达，其中亲脂性底物与葡萄糖醛酸偶联，在体内将亲水性葡糖苷酸转运出细胞，主要参与机体代谢反应［17］。Nr1h4 是在肝脏、肠道和肾脏中高度表达是一种主要的核胆汁酸受体，可通过抗炎、抗氧化应激、抗纤维化等发挥保护肾脏疾病的作用，它还在肾脏的葡萄糖和脂质代谢中发挥作用［18-19］。核心靶点还显示出现了多种载脂蛋白的失调，如APOA2 等，还有趋化因子、生长因子等，这些蛋白大多数与巨噬细胞功能相关，并在CKD 患者中表达下调。

4 结论

益肾清利活血方可以保护肾功能，降低肾脏组织中炎症和胶原沉积，转录组分析发现其与脂肪酸代谢、铁死亡、IL-17信号通路等密切相关。