不同松花粉提取物对环磷酰胺诱导大鼠卵巢损伤的保护作用

刘其耸，陈 阳，杨长军，何毓婕，陈秋铭，何志勇，王召君，陈 洁，曾茂茂,*

（1.烟台理工学院食品与生物工程学院，山东 烟台 264000；2.烟台新时代健康产业有限公司，山东 烟台 264006；3.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

卵巢是雌性动物卵泡发育，黄体形成、退化和排卵以及类固醇激素合成的生殖器官，其分泌的性腺类固醇激素、前列腺素等多种激素和生长因子控制着机体的发育和生理活动[1]。医疗相关卵巢损伤主要是指手术或放化疗对卵巢结构和功能所造成的损伤，可见于妇科良恶性肿瘤的治疗过程中[2]。环磷酰胺是临床上最常用的药物之一，对多种肿瘤及自身免疫性疾病具有良好的治疗效果，但其作为烷化剂是公认的对卵巢损伤最大的化疗药物，会导致用药患者卵巢功能损伤、生育能力下降，还可能影响终身健康[3]。环磷酰胺诱导卵巢损伤机制相关的信息很少，目前多将其归因于氧化应激、炎症和细胞凋亡[4]。一些天然产物被证明可对环磷酰胺诱导的卵巢损伤起到有效的保护作用[5]，具体效果取决于所含有效单体成分的种类与含量。由于具有良好的抗氧化特性[4]，已有较多的植物单体成分被证实具有卵巢保护的功效，如白藜芦醇[6]、槲皮素[7]、盐酸益母草碱[8]、表没食子儿茶素没食子酸酯[9]、淫羊藿苷[10]、辅酶Q10[11]和人参皂苷Rb1[12]等诸多黄酮、多酚和三萜类小分子化合物，更大分子质量的富硒蛋清肽（分子质量为200～1 000 Da的组分占比达98.33%）[13]、壳寡糖（水溶，分子质量≤2 000 Da）[14]，以及来源于动植物的鱿鱼墨多糖[15]、透明质酸[16]、岩藻聚糖硫酸酯[17]等大分子。对环磷酰胺诱导卵巢损伤具有保护作用的物质在分子质量及溶解性上具有较大差异，这可能与疾病发生涉及机体内的多个通路及靶点有关[18]。

松花粉是松科植物马尾松、油松或其同属植物的雄性生殖细胞，是一种药食同源的原料，目前已在扶正化瘀片（胶囊）、清肺止咳散和哮喘丸等中成药中广泛应用。研究发现，松花粉中含有维生素、酚酸、黄酮、萜类、生物碱、有机酸、氨基酸及其衍生物、脂类、糖及醇类和核苷酸及其衍生物等小分子物质[19]，以及多糖[20]和蛋白质[21]等大分子物质。松花粉的乙醇提取物和水提物都具有较好的抗氧化活性[22]，并可改善机体的炎症症状[23]，调节细胞凋亡[24]。本课题组的前期研究证实松花粉可以有效保护环磷酰胺诱导的卵巢损伤[25]，并通过广泛靶向代谢组学发现松花粉可以通过影响α-亚麻酸代谢、VB6代谢、嘌呤代谢、赖氨酸降解和糖酵解/糖异生途径促进肝脏代谢由紊乱向正常水平回归[18]，这可能是松花粉“从肝论治卵巢早衰”干预环磷酰胺诱导卵巢损伤的机制之一[26]。中药强调多组分多靶点协同作用，但因中药成分多样、与机体相互作用非常复杂，直接揭示其混合组分在分子水平上的作用机制非常困难。通过按照分子质量大小和化合物溶解性差异等理化性质对松花粉组分进行分离，进而验证各组分对卵巢的保护效果，结合统计分析可以筛选效应组分以及确定其相应的主要干预途径。

本研究分析松花粉水提物、水提大分子化合物（＞5 kDa）、乙醇提物和乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）4 种松花粉提取物的总糖、粗多糖、总酚和总黄酮等组成，并探讨各提取物对摄入环磷酰胺大鼠的卵巢保护作用，包括卵巢形态、抗氧化能力、细胞凋亡能力和抗炎能力等，进一步通过统计分析对松花粉的效应组分进行筛选，旨在对后续准确解析松花粉内对于卵巢损伤具有保护作用的药效物质及其体内作用机制提供指导。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

SD大鼠（雌性，10 周龄，体质量约250 g），由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供（生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001）。

破壁云南松花粉 新时代健康产业（集团）有限公司；环磷酰胺一水合物 上海源叶生物科技有限公司；补佳乐戊酸雌二醇片 拜耳医药保健有限公司。

甲醛溶液、甲醇、福林-酚试剂 中国医药集团有限公司；RIPA细胞裂解液 武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-4试剂盒，总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力测定试剂盒，脂质氧化检测试剂盒，一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光），BCA蛋白浓度测定试剂盒，伊红-苏木素（hematoxylin &eosin，H&E）染色试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

ASP300S全自动脱水机、EG1150H组织包埋机、RM2245转轮式切片机、ST5010自动载玻片染色机德国Leica仪器有限公司；Trans-Blot Turbo半干转印系统、164-5050基础电源电泳仪、165-8003小型垂直电泳槽 美国Bio-Rad公司；iBright FL1500成像系统美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 松花粉提取物的制备

水提物的制备：称取100 g破壁松花粉，溶于2 L超纯水。在45 ℃超声搅拌3 h，抽滤，重复3 次后合并滤液，冻干，得到松花粉水提物；水提大分子化合物的制备：水提物制备中合并的滤液使用5 kDa的膜超滤后保留截留液，冻干，得到水提大分子化合物（＞5 kDa）；乙醇提物的制备：取100 g破壁松花粉溶于2 L体积分数70%乙醇溶液。在45 ℃超声搅拌3 h，抽滤，重复3 次后合并滤液，40 ℃旋转蒸发全部乙醇，冻干，得到松花粉乙醇提物；乙醇提小分子化合物的制备：松花粉醇提物制备中合并的滤液使用5 kDa的膜超滤后保留透过液并再次超滤。第2次的透过液在40 ℃旋转蒸发，冻干，得到乙醇提小分子化合物（＜5 kDa）。

1.3.2 松花粉提取物总糖、粗多糖、总酚和总黄酮含量的测定

采用GB/T 15672—2009《食用菌中总糖含量的测定》[27]中的苯酚-硫酸法对松花粉中总糖含量进行测定。采用袁桂香等[28]的水提醇沉法提取多糖，用苯酚-硫酸法测定粗多糖含量。依据梅进等[29]的方法测定松花粉中总酚含量。依据黄雪秋等[30]的方法测定松花粉中总黄酮含量。

1.3.3 动物实验

大鼠适应性喂养1 周，除空白对照组8 只之外，其余进行环磷酰胺诱导卵巢损伤，空白对照组腹腔注射等体积生理盐水。取造模成功的56 只大鼠随机分为7 组，每组8 只，灌胃方式如表1所示，连续灌胃28 d。末次给药后，大鼠禁食12 h后使用异氟烷吸入麻醉。迅速取出卵巢，剔除所有脂肪后称质量，计算卵巢指数。称质量后的卵巢一半用质量分数4%多聚甲醛溶液固定，一半置于液氮中存于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3.4 大鼠卵巢组织病理学观察

4%多聚甲醛溶液中的卵巢使用梯度酒精脱水，石蜡包埋，连续切片，H&E染色后，于光学显微镜下进行组织病理学观察并拍照记录，观察内容包括卵巢的始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡、闭锁卵泡、黄体数的差异，以及卵巢皮质、髓质、颗粒细胞和细胞间质等其他病理改变。

1.3.5 酶联免疫吸附法检测大鼠卵巢炎症因子和抗氧化能力

采用商业化试剂盒测定卵巢中的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-4水平，以及SOD、GSH-Px、CAT的活力、T-AOC水平和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平，具体步骤严格按照说明书执行。

1.3.6 大鼠卵巢颗粒细胞TUNEL检测

采用商业化试剂盒测定卵泡周围颗粒细胞的凋亡水平，具体步骤严格按照说明书进行。操作完成后于荧光显微镜下拍摄清晰照片用于凋亡细胞计数和凋亡指数计算，计算公式如下：

1.3.7 蛋白质免疫印迹法（Western blot，WB）检测大鼠卵巢凋亡蛋白表达

冷冻的卵巢在冰上剪切后，于RIPA裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）中充分匀浆，静置30 min，以14 000 r/min离心10 min。以蛋白浓度最低的样品为基准进行凝胶电泳，并使用半干转印系统将蛋白从凝胶转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。PVDF膜置于封闭液中，室温封闭2 h。封闭后PVDF膜用TBST洗涤3 次，加入不同的一抗（表2），4 ℃孵育过夜。一抗孵育后，用Tris含吐温-20缓冲盐溶液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3 次，每次20 min，然后二抗室温孵育1 h。用TBST洗涤3 次，每次20 min，然后将增强型化学发光试剂均匀滴在PVDF薄膜上，用化学发光成像检测仪检测发光强度并拍照。

表2 WB抗体信息Table 2 Information about antibodies used for WB

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 松花粉4 种不同提取物的成分分析

松花粉4 种提取物中的总糖、粗多糖、总酚和总黄酮含量如表3所示。可以发现，水提物中的糖类物质的含量较醇提物更高，而酚类及黄酮类物质则相反，在乙醇提物中含量更高（P＜0.05）。通过使用5 kDa的膜超滤后的水提大分子化合物中含有更多的糖类，且粗多糖相对总糖占比由22.59%增加至28.65%，总黄酮流失更为严重；乙醇提小分子化合物中总酚、总黄酮含量有所富集，总糖含量下降最为显著。以往研究中证实植物多糖及多酚、黄酮类物质都可以对环磷酰胺诱导的卵巢损伤起到保护作用[7,17]，本研究制备所得的4 种提取物在这些主要活性成分含量上差异显著（P＜0.05），通过验证4 种提取物对环磷酰胺诱导卵巢损伤的保护效果，可以为后续筛选松花粉中确切具有卵巢保护作用的单一组分糖类抑或是多酚黄酮类的药效物质提供指导，并可通过不同组分作用途径的差异为更加科学的食品或药品复配提供理论依据。

表3 松花粉4 种提取物的功效成分含量Table 3 Contents of four functional components in pine pollen extracts mg/g

2.2 松花粉提取物对卵巢损伤大鼠卵巢形态的影响

经各松花粉提取物灌胃后，与模型组相比，乙醇提物组、乙醇提小分子化合物组和水提大分子化合物组均对卵巢指数有显著提升，而原粉组和水提物组没有显著提升。从卵巢形态的结果来看，模型组较空白组的始基卵泡差异不明显，初级、次级和成熟卵泡及黄体数量下降显著，闭锁卵泡则显著增加（图1），符合以往文献报道中环磷酰胺破坏发育中卵泡这一现象[31]。相比于模型组，阳性组的始基卵泡和闭锁卵泡数量大量下降，初级卵泡变化不明显，次级和成熟卵泡及黄体数量一定程度上恢复。原粉组黄体数量比阳性组少，低于空白组，水提物组具有与原粉组类似的结果。乙醇提物组的初级和次级卵泡数量显著下降，而成熟卵泡明显增加，闭锁卵泡数量最少。除黄体和闭锁卵泡两项，水提大分子化合物组与水提物组结果相似，水提大分子化合物组增加了黄体数量，但对于减少闭锁卵泡的效果最差。乙醇提小分子化合物组对减少闭锁卵泡的效果仅次于乙醇提物组，成熟卵泡数量与空白对照组持平，但初级卵泡和次级卵泡数量比空白对照组少。结果表明，各松花粉提取物均对卵巢形态改善具有正面作用，但对卵巢各组织结构的改善效果具有差异。基于水提物和乙醇提物中多糖和小分子抗氧化化合物组成的差异，可以认为松花粉对卵巢形态的影响是多组分多靶点共同作用的结果，探究各组分的作用机理有助于通过对其进行合理组合，以发挥更全面和显著的保护卵巢效果。

图1 SD大鼠卵巢组织病理学切片Fig.1 Histopathological sections of SD rat ovaries

2.3 松花粉提取物对环磷酰胺诱导卵巢损伤大鼠卵巢抗氧化能力的影响

如图2所示，相较于空白对照组，模型组的卵巢T-AOC显著下降了12.52%，GSH-Px、SOD和CAT活力显著下降了50.05%、53.80%和63.75%，MDA水平显著上升了103.38%（P＜0.05）。与模型组相比，除水提大分子化合物组外，其余各组的卵巢抗氧化能力均有显著提升，其中提升最大的是乙醇提小分子化合物组，其次是乙醇提物，两组分别将T-AOC、GSH-Px活力、SOD活力和CAT活力显著提高了25.81%、16.03%，109.90%、104.31%，120.63%、91.62%和237.09%、138.42%，并将MDA水平显著降低了48.43%、53.42%（P＜0.05）。乙醇提物提升机体抗氧化能力的效果也优于水提物，并且乙醇提物和乙醇提小分子化合物的卵巢GSH-Px和CAT活力无显著差异（P＞0.05）。水提大分子化合物组在各项抗氧化指标方面的表现不如水提物组，表明水提物对卵巢抗氧化方面的提升可能更多是受水溶性小分子化合物的影响。对于水溶性多糖大分子、醇溶性多酚和黄酮等小分子提升机体内抗氧化酶活力及降低MDA含量均有所报道[32]，但本研究发现相对模型组而言，松花粉水提大分子化合物提升机体内抗氧化酶活力及降低脂质氧化不显著（P＞0.05），表明松花粉多糖等水溶性大分子物质与小分子化合物在通过调节卵巢氧化应激保护卵巢机制方面存在差异，这可能是松花粉多糖等水溶性大分子物质无法进入胞内作用于相关靶点的原因。

图2 SD大鼠卵巢T-AOC（A）、GSH-Px（B）、SOD（C）、CAT（D）、MDA（E）水平（n＝5）Fig.2 Levels of T-AOC (A),GSH-Px (B),SOD (C),CAT (D) and MDA (E) in SD rat ovaries (n=5)

2.4 松花粉提取物对卵巢损伤大鼠卵巢抗炎能力的影响

TNF-α和IL-6被认为是促炎因子[33]，而IL-4是抑炎因子[34]。如图3所示，与空白对照组相比，模型组的TNF-α、IL-6和IL-4均显著提升，分别提升了190.25%、106.60%和104.04%（P＜0.05），与以往报道中环磷酰胺诱导效果相同[35]，表明环磷酰胺扰乱了大鼠体内免疫应答系统。各松花粉提取物均能显著回调炎症因子水平（P＜0.05），且水提物和水提大分子化合物降低促炎因子的效果略好于乙醇提物及乙醇提小分子化合物，但无显著差异（P＞0.05）。结果表明，除了在回调TNF-α时水提物与水提大分子化合物的效果略好，可以认为松花粉4 种提取物在通过抗炎机制保护环磷酰胺诱导的卵巢损伤方面具有相似效果。

图3 SD大鼠卵巢TNF-α（A）、IL-4（B）和IL-6（C）水平（n＝6）Fig.3 Levels of TNF-α (A),IL-4 (B) and IL-6 (C) in SD rat ovaries (n=6)

2.5 松花粉4 种不同提取物对卵巢损伤大鼠卵巢抗细胞凋亡能力的影响

如表4所示，模型组的卵泡颗粒细胞凋亡指数为（83.40±5.37）%，远高于其余各组（P＜0.05）。松花粉原粉、水提物、乙醇提物、水提大分子化合物、乙醇提小分子化合物分别将凋亡指数显著降低了50.71%、62.04%、48.29%、55.42%和51.66%，表明松花粉各组分都对调控卵巢颗粒细胞凋亡有积极影响。相比水提物组，水提大分子化合物组凋亡指数升高了11.78%（P＜0.05）；相比醇提物组，醇提小分子化合物组的凋亡指数下降了6.91%（P＜0.05），表明小于5 kDa的小分子化合物能有效减少颗粒细胞的凋亡。水提物细胞凋亡指数显著低于醇提物，这可能与有效小分子化合物水溶性高于醇溶性，因而在水提物中的含量高于在醇提物中的含量有关。程妮等[36]研究证明松花粉水提取物和乙醇提取物中均检出原儿茶酸、咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸4 种酚酸类物质，且在水提取物中的含量均比乙醇提取物中含量高，其中咖啡酸[37]已被证明可以减少卵巢颗粒细胞的凋亡。

表4 8 组大鼠颗粒细胞凋亡指数（n＝5）Table 4 Apoptosis index of granulosa cells in rats from eight groups (n =5)

2.6 4 种松花粉提取物对卵巢损伤大鼠卵巢凋亡蛋白表达的影响

在研究的5 种凋亡相关蛋白中，Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白[38]，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3是促凋亡蛋白，其中Cleaved Caspase-3是Caspase-3的活化形式，仅存在于正在凋亡的细胞中[39]。如图4所示，模型组较空白组的Bcl-2蛋白含量下降，Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3含量均显著上升。与模型组相比，松花粉原粉及4 种提取物组均显著上调了Bcl-2蛋白表达，下调了Caspase-3和Cleaved Caspase-3蛋白表达（P＜0.05）。研究认为，Bcl-2与Bax的比值对细胞接受凋亡信号刺激后是否存活起关键作用[40]。本研究结果显示，乙醇提物组与乙醇提小分子化合物组的Bcl-2/Bax值显著高于水提物组和水提大分子化合物，而Cleaved Caspase-3的表达则显著低于水提物组与水提大分子化合物组（P＜0.05），说明乙醇提物与乙醇提小分子化合物调控卵巢抗凋亡蛋白表达能力最强，其次是水提物和大分子水提取物。卵巢凋亡蛋白表达与颗粒凋亡指数的结果存在差异，表明4 种松花粉提取物在通过调控凋亡蛋白表达，进而减少卵巢细胞凋亡的机制方面存在较大差异。

图4 8 组大鼠卵巢凋亡蛋白表达（n＝3）Fig.4 Expression of apoptosis-related factors in rat ovaries from eight groups (n =3)

2.7 4 种松花粉提取物对卵巢损伤大鼠影响的聚类分析及相关性分析

图5A显示，模型组与其余组分为两大簇，表明4 种提取物都可以一定程度上缓解卵巢损伤。其中，阳性对照组与空白组分为一簇，与乙醇提小分子化合物和乙醇提物归为一簇，与水提大分子化合物、松花粉原粉和水提物归为一簇。聚类分析的结果证明了乙醇提小分子化合物和醇提物具有比松花粉原粉、水提物和水提大分子化合物更好的效果。图5B的相关性分析结果显示，总酚和总黄酮与闭锁卵泡间形成负相关，总糖和粗多糖并未表现出与闭锁卵泡的任何相关性；此外，总酚和总黄酮在提升机体抗氧化力、降低脂质氧化以及抑制促凋亡蛋白表达方面的效果好于总糖和粗多糖，这在一定程度上解释了富集多酚和黄酮的乙醇提小分子物和乙醇提物具有更好卵巢保护作用的现象。但值得注意的是，糖类与TNF-α具有更强的负相关特性（P＜0.05），即清除促炎因子TNF-α可能是松花粉多糖发挥保护卵巢作用的途径。

图5 不同实验组别大鼠的聚类分析（A）与松花粉提取物和体内指标间的相关性分析（B）Fig.5 Cluster analysis of rats in different experimental groups (A) and correlation analysis between pine pollen extracts and physiological indices in rats (B)

3 结论

本研究分析了4 类松花粉提取物中的糖类、黄酮和多酚的含量，水提物及水提大分子化合物糖类含量较高，而乙醇提物及乙醇提小分子物则含黄酮和多酚较多，且经过进一步制备的水提大分子化合物和乙醇提小分子化合物进一步提升了其中的主要活性物质含量。松花粉的4 种提取物均在一定程度上减少了环磷酰胺诱导的卵巢损伤，但醇提物及乙醇提小分子化合物通过减少闭锁卵泡，提高卵巢抗氧化能力，调控卵巢凋亡细胞蛋白表达等保护卵巢，而松花粉多糖则通过清除促炎因子TNF-α保护卵巢。后期通过进一步分离多酚黄酮类小分子药效物质及多糖类物质，有利于制作组分明晰、作用途径可控的松花粉产品。