六堡茶真菌固态发酵优势单菌的筛选

吴新惠，杜金杰，刘晓纯，廖楷滨2,，覃玉娜2,，梁炜杰2,，张灵枝2,，龙志荣，邱瑞瑾,*

（1.梧州市农业科学研究所/广西壮族自治区农业科学院梧州分院，广西 梧州 543003；2.广西六堡茶生物学与资源利用重点实验室，广西 梧州 543003；3.韶关学院生物与农业学院，广东 韶关 512000；4.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；5.梧州市茶产业发展服务中心，广西 梧州 543000）

六堡茶属黑茶类，是国家地理标志保护产品，因原产于梧州苍梧六堡镇而得名，是广西特有的历史名茶[1]。六堡茶饮用历史悠久，特殊的地理环境和生产工艺造就其特殊的品质风味。适度渥堆和陈化是使六堡茶保持良好风味的关键工序[2-3]。与其他五大类黑茶不同，六堡茶在渥堆、陈化和贮存过程中细菌和真菌持续的生理活动，使六堡茶“越陈越好”，因而六堡茶有“耐于久藏，且越陈越香”之说[4-5]。真菌在传统食品发酵中有着广泛的应用，前人研究表明真菌是影响黑茶发酵过程的关键因素[6-9]。但传统渥堆工艺无法控制发酵过程中的菌种类型，容易滋生多种杂菌，复杂多样的微生物参与发酵导致六堡茶品质不稳定、难以控制。因此，筛选有益菌株进行固态发酵，探索不同真菌发酵对六堡茶品质的影响对六堡茶发酵菌种工业化应用有积极意义。

固态发酵是指在固态基质中加入微生物进行发酵的过程，固态培养基不溶于水，可以为微生物提供生长所需的营养及生存环境[10]。微生物在茶叶固态发酵中可以保持自然的生长状态，代谢产物更容易积累，更具丰富性，且固态发酵含水量低，生产成本也较低。人工接种真菌固态发酵不仅可以解决自然渥堆发酵品质参差不齐、卫生安全等问题，还能赋予茶叶丰富的滋味品质和独特的保健功效[6,11]。杨洪元[12]利用从六堡茶中分离到的真菌进行组合混菌发酵毛茶，结果显示，接种组合青霉＋冠突曲霉＋黑曲霉＋毛霉＋酵母菌发酵可以取得与传统渥堆六堡茶品质相近的效果，且发酵时间缩短了近1/3。胡沛然[13]利用从渥堆样品中分离鉴定出的产多酚氧化酶的嗜热菌（灰黄青霉、黑曲霉和烟曲霉）固态发酵六堡茶，发现随着发酵时间的延长，3 种嗜热真菌发酵茶的茶多酚含量均呈降低趋势，其中转化效果最明显的是烟曲霉发酵组，各发酵组的茶黄素含量均下降，茶红素和茶褐素含量变化不同。刘琨毅等[14]将地衣芽孢杆菌L1接种于灭菌和未灭菌的晒青茶中，发现地衣芽孢杆菌与其他微生物可能产生协同作用，从而改变普洱茶中的特征成分、提升普洱茶的感官品质。王琪琪[15]以福鼎大白茶青为原料，接种人工益生菌群（阿姆斯特丹散囊菌、异常威克汉姆酵母、汉逊酵母、酿酒酵母、解淀粉芽孢杆菌）固态发酵茶叶，茶汤颜色从红亮转变为琥珀色，滋味甜醇，青气消失，有菌香。近年来，许多学者通过研究进一步证明了真菌发酵可以显著提升茶叶品质，比如冠突散囊菌影响茯砖茶的发花工艺[16-19]。人工接种固态发酵不仅可以提升茶叶渥堆发酵效率、缩短发酵时间，还可以提升茶叶品质，是一种高效而有益的茶叶发酵方法。

本研究利用课题组前期从六堡茶渥堆与蒸压工艺中分离的20 株真菌进行固态发酵[20]，以广西梧州苍梧县群体种毛茶作原料、无菌处理组为空白对照，以六堡茶“红、浓、陈、醇”的特征品质作为参考标准，定期抽样检测分析其中感官品质和化学成分变化，探索不同真菌在六堡茶原料中的生长特性及发酵品质变化规律，筛选可显著提升六堡茶品质或赋予六堡茶新风味的固态发酵优势真菌，以期为后期人工控菌发酵六堡茶提供优良菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 发酵茶样

发酵毛茶由苍梧县群体种六堡茶一芽三叶鲜叶加工制成。

1.1.2 发酵真菌来源

用于固态发酵的20 株真菌从课题组前期实验中分离筛选得到，大多为六堡茶或其他黑茶中发现并报道过的真菌，对黑茶发酵品质的转化有一定贡献作用[20]，如表1所示。

表1 从渥堆六堡茶中分离鉴定到的20 株真菌Table 1 Twenty fungal strains isolated and identified from pile fermented Liupao tea

1.1.3 试剂

儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin-3-gallate，ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、咖啡因 上海源叶生物科技有限公司；甲醇（色谱级）美国Thermo Fisher Scientific公司；蒽酮 天津市科密欧化学试剂有限公司；福林-酚、磷酸氢二钠、茚三酮、磷酸二氢钾、硫酸、碳酸钠、蒽酮、氯化铝（均为分析纯）天津化学试剂有限公司。其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WFJ7200型可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；TD-5Z型低速离心机 四川蜀科仪器有限公司；SW-CJ-2F双人双面超净工作台 苏州净化设备有限公司；GXZ-250A恒温光照培养箱 宁波江南仪器厂；ALANCE E295高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪、C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）美国Waters公司；血球计数板 上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固态发酵

1.3.1.1 六堡毛茶准备

称取100 g毛茶于500 mL锥形瓶，封口膜封好，于高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，得到灭菌待接种毛茶，备用。

1.3.1.2 菌悬液的制备

菌种活化：取冻存的菌种置于28 ℃恒温箱，24 h后在超净工作台中吸取0.5 mL解冻后的菌悬液于PDA培养基和CA培养基中用无菌涂布棒均匀涂布，密封后置于28 ℃培养箱培养4～7 d，进行活化。

孢子悬液制备：将活化后的真菌用划线法接种于PDA培养基、CA培养基上，28 ℃恒温培养4～7 d，得到F1，再划线培养生长5～10 d得到F2，用无菌生理盐水洗脱F2孢子并转移至锥形瓶（带灭菌玻璃珠和适量无菌水），于摇床中振荡约4～8 h（150～170 r/min），采用血球计数板计数孢子浓度并调节孢子浓度约为1×107CFU/mL，保存备用。

1.3.1.3 接种菌悬液固态发酵

100 g六堡毛茶于121 ℃高压灭菌20 min后冷却备用。按照1×107CFU/mL浓度接种菌悬液至灭菌毛茶培养，同时调整发酵水分质量分数为25%，于28 ℃、相对湿度80%的培养箱中发酵，每天观察生长情况。7 d后，待菌长势正常，1 周内梯度升温至55 ℃（每7 d循环一次梯度升温程序），模拟实际生产的渥堆升温和翻堆降温过程。为避免茶样结块，发酵前7 d每隔2 d摇一次瓶，后期按照升温梯度7 d一次，使茶样发酵均匀。于14、21、28、35 d定时取样（发酵期间定期审评，21 d时若审评滋味仍然较涩或无特征香气就停止发酵）。以不接种只加无菌纯水的灭菌毛茶作为对照（CK）。每组样品均进行3 次重复发酵。

1.3.1.4 固样处理

参考曾贞等[21]的微波固样法，微波炉额定输出功率850 W，额定微波频率2 450 MHz。100%火力固样3 min，20%火力微波固样8 min（分为3 次处理：4、2、2 min），最后用烘箱70～80 ℃烘至足干。烘干后，一部分保存于-18 ℃冰箱冷冻，用于感官审评；另一部分磨成茶粉，保存于（0～4 ℃）冰箱冷藏，用于检测理化成分指标。

1.3.2 主要化学成分的检测

水浸出物总含量测定参照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》[22]；游离氨基酸总含量测定参照GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》[23]；黄酮类化合物总含量测定采用三氯化铝比色法；可溶性糖总含量测定采用蒽酮-硫酸比色法；茶色素总含量测定采用系统分析法；咖啡碱总含量测定参照GB/T 8312—2013《茶 咖啡碱测定》[24]；茶多酚含量、儿茶素组分含量测定参照GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[25]。

1.3.3 HPLC样品制备

1.3.4 HPLC分析

流动相及色谱条件：流动相A：90%甲醇溶液（平衡柱子）；流动相B：5%甲醇溶液；流动相C：0.05%磷酸溶液；流动相D：100%乙腈；流速：1 mL/min；波长：280 nm；后运行时间：5 min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。洗脱条件：0～3 min，95%～90% A，5%～10% B；3～6 min，90% A，10% B；6～8 min，90%～80% A，10%～20% B。HPLC洗脱梯度程序见表2。

表2 HPLC洗脱梯度Table 2 Gradient elution parameters for HPLC

1.3.5 感官审评

按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》中黑茶（散茶）的审评方法，审评小组由5 位具有专业茶叶审评资格的小组成员（2 男3 女）组成，用专业的茶叶审评术语得出审评结果。

1.4 数据处理与分析

测定结果取3 次重复实验的平均值。采用Excel 2016软件进行数据处理，采用SPSS 24软件进行方差分析和显著性分析，多重比较采用最小显著性差异法（LSD法），数据用表示，使用GraphPad Prism 8软件作图，Origin 2021软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA），采用Photoshop软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同真菌发酵对六堡茶感官品质的影响

CK组及20 株单菌固态发酵茶样如图1～3所示，审评结果如表3、4所示，其中依照发酵状态调整，10 种真菌发酵21 d，有2 个时间节点发酵样（14、21 d），另外10 种真菌发酵35 d，有4 个时间节点发酵样（14、21、28、35 d）。

图1 CK组外形、汤色和叶底Fig.1 Tea,infusion and brewed tea leaves in the control group

表3 单菌发酵4 个时间节点审评结果Table 3 Sensory evaluation results of Liupao tea at four time points of single-culture fermentation

从图1、表3可知，无菌对照CK组感官审评结果在4 个时间节点均无明显差异，干茶外形乌褐油润，开汤后香气纯正、生晒味，汤色橙黄，清澈明亮，滋味浓强苦涩，叶底绿褐，与毛茶感官品质接近，说明在无菌状态下仅有的湿热作用对六堡茶感官品质影响不大。

六堡茶品质以红、浓、陈、醇为特征，如图2、表3所示，这10 种真菌接种固态发酵后在4 个时间节点上均能显著改善六堡茶汤色、香气或滋味品质。其中，能显著改善茶叶汤色的有芒果青霉、角膜曲霉、赤曲霉、间型曲霉、阿姆斯特丹曲霉、极细枝孢霉；呈陈香、木香、菌香、药香、参香等香气特征的有塔宾曲霉、黑曲霉、赤曲霉、间型曲霉、团青霉、阿姆斯特丹曲霉，而极细枝孢霉发酵21 d和28 d有较为独特的玫瑰花香；在滋味方面，10 个真菌发酵21、28 d的茶样滋味均较为醇厚顺滑，而发酵到35 d部分茶样滋味变苦涩、变酸，推测在本实验条件下这些真菌接种发酵时间不宜过长。部分真菌发酵茶样香气到35 d时下沉，变粗杂，甚至出现酸味，说明发酵过度，如塔宾曲霉和团青霉。对比在同一时间的外形、汤色及滋味特征发现，茶样表面孢子生长越旺盛，茶汤颜色越深、滋味越醇和；外形越接近毛茶和无菌对照发酵样，其汤色越浅、滋味越苦涩。综上，单菌最佳发酵时间为21 d。

从表4可以看出，29家医养结合型养老机构中的20家综合效率值为1，视为DEA有效，另外9家处于弱DEA有效，即在规模效率或纯技术效率值上没有达到最优，其中，最低的是机构10，其综合效率仅为0.675，相对于其他养老机构而言，其投入的资源没有得到充分利用。在规模报酬可变的情况下，纯技术效率值为1的有23家，占比79.31%；而从规模效率角度分析，20家规模效率有效，9家处于规模效率无效的状态，还存在通过改变规模提高效率的空间。

图2 不同真菌固态发酵样4 个时间节点汤色（A）、外形（B）和叶底（C）Fig.2 Tea infusion (A),tea (B),and brewed tea leaves (C) at four time points of solid-state fermented with different fungi

由图3、表4可知，单菌接种固态发酵14 d后所有菌株在茶叶表面长势各异，曲霉属真菌和青霉属真菌在茶叶表面长势相较于其他属真菌更旺盛，部分样品发酵14 d和21 d的外形无差异，滋味变化不大，苦涩味仍在。其中也有香气较为突出的发酵菌种，如鲜红青霉、聚多曲霉、产黑色素短梗霉，发酵后只能对六堡茶某一感官品质产生有益的影响，未来可以考虑混菌发酵，突出其发酵特征。

图3 不同真菌固态发酵样2 个时间节点外形、汤色和叶底Fig.3 Tea,infusion and brewed tea leaves at two time points of solidstate fermentation with different fungi

表4 单菌发酵2 个时间节点审评结果Table 4 Sensory evaluation results of tea samples at two time points of single fungal fermentation

综合感官审评的汤色、香气和滋味，从60 种发酵茶样中筛选出9 种（21 d）发酵茶样用于理化成分分析，分别为LB-5、LB-10、LB-22、LB-24、LB-32、LB-35、LB-43、LB-55、LB-81，探究9 种真菌发酵21 d对六堡茶滋味品质成分的影响。

2.2 不同真菌发酵对六堡茶生化成分的影响

2.2.1 PCA

如图4所示，基于18 种生化成分，PCA和HCA结果表明9 种不同真菌发酵六堡茶和CK组差异显著。PCA将各处理组划分为3 组。组1包括CK、团青霉和赤酵母组，组2包括塔宾曲霉、黑曲霉、角膜曲霉、赤曲霉、间型曲霉、阿姆斯特丹曲霉组，组3为芒果青霉组。PC1和PC2分别解释总方差的44.93%和21.57%。CK、团青霉、赤酵母与其他发酵茶样的成分差异显著（P＜0.05）；芒果青霉与其他发酵茶样相比，在PC2的权重上被区分开。总儿茶素、GCG、EGCG、ECG和茶红素分别是PC1的前5 位贡献物质，游离氨基酸、黄酮、茶黄素、EC和GC是PC2的前5 位贡献物质（表5）。此外，HCA将生化成分聚为两簇，EGC、咖啡碱、茶褐素和水浸出物聚为一簇，其他14 种成分聚为另一簇。

图4 不同茶样中18 种特定化学成分的PCA（A）和HCA（B）Fig.4 PCA (A) and HCA (B) plots of 18 chemical components in different tea samples

表5 单菌发酵六堡茶中18 种主要化学成分对PC1与PC2的贡献度Table 5 Contribution rates of 18 major chemical components of Liupao tea fermented by single fungal strains to PC1 and PC2

2.2.2 不同茶样理化成分的变化

从表6可知，与CK组相比，六堡毛茶经9 种不同真菌发酵21 d后，黑曲霉、赤曲霉、间型曲霉、团青霉发酵茶样的水浸出物含量显著下降（P＜0.05），塔宾曲霉、阿姆斯特丹曲霉发酵样含量极显著增加（P＜0.01），明显高于其他真菌发酵的六堡茶，结合感官审评结论可知，这两种真菌发酵的六堡茶茶汤滋味醇厚。与CK样相比，9 株真菌发酵样茶多酚含量呈极显著变化（P＜0.01），除赤酵母发酵样极显著增加外（P＜0.01），其他8 种真菌发酵茶的茶多酚含量极显著减少（P＜0.01），其中降幅最大的是芒果青霉。

表6 单菌发酵六堡茶理化成分Table 6 Chemical components of Liupao tea fermented by single fungal strains %

9 种真菌固态发酵茶样在21 d时，黑曲霉、芒果青霉、赤曲霉、间型曲霉、团青霉、和赤酵母发酵茶的茶黄素含量极显著减少（P＜0.01），塔宾曲霉和阿姆斯特丹曲霉发酵茶的茶黄素含量显著减少（P＜0.05），而角膜曲霉无显著变化。相比于CK组，所有真菌发酵茶样的茶褐素含量均极显著增加（P＜0.01），特别是塔宾曲霉、黑曲霉、阿姆斯特丹曲霉。各组的茶红素含量也呈极显著变化；与CK组相比，除了赤酵母极显著升高外（P＜0.01），其他真菌发酵均呈极显著降低（P＜0.01）。9 种真菌发酵茶样可溶性糖含量均呈极显著下降趋势（P＜0.01）。

2.2.3 儿茶素组分含量的变化

儿茶素是茶多酚中含量最高的化合物，其含量的多少与茶汤的苦涩味强度呈正相关，主要包括C、EC、GC、EGC、CG、ECG、GCG、EGCG 8 种单体，前4 种为非酯型儿茶素，后4 种为酯型儿茶素。不同标准品HPLC见图5。

图5 不同标准品的HPLCFig.5 HPLC chromatograms of catechin standards

从表7、8 可知，与对照组相比，黑曲霉、角膜曲霉、间型曲霉、团青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤酵母发酵茶的非酯型儿茶素含量均极显著减少（P＜0.01）。塔宾曲霉、黑曲霉、芒果青霉、赤曲霉、间型曲霉、团青霉、阿姆斯特丹曲霉发酵茶的酯型儿茶素含量均极显著减少（P＜0.01），赤酵母显著减少（P＜0.05），角膜曲霉无显著变化。与CK组相比，9 种真菌发酵茶中GC、ECG含量均呈极显著变化（P＜0.01），只有芒果青霉和赤曲霉发酵六堡茶的GC含量极显著上升（P＜0.01），塔宾曲霉、黑曲霉、间型曲霉、团青霉、阿姆斯特丹曲霉、赤酵母发酵茶样的GC含量极显著降低（P＜0.01），角膜曲霉发酵茶显著降低（P＜0.05）。与CK相比，芒果青霉和赤曲霉、间型曲霉发酵茶中EGC含量均无显著差异，而其他6 种真菌发酵茶EGC含量均极显著减少（P＜0.01）。角膜曲霉、赤曲霉和赤酵母发酵六堡茶的C含量无显著变化，其他5 种真菌发酵茶均呈极显著减少（P＜0.01）。塔宾曲霉、黑曲霉、团青霉接种发酵21 d后EC含量呈极显著减少（P＜0.01），而赤曲霉发酵茶呈极显著增加（P＜0.01）。9 种真菌发酵茶的酯型儿茶素含量除角膜曲霉和赤酵母外，均呈极显著减少（P＜0.01）。EGCG含量除了角膜曲霉和赤酵母发酵茶无显著变化外，其他真菌发酵茶均极显著降低（P＜0.01）；9 种真菌发酵茶样的GCG含量均呈极显著降低（P＜0.01），特别是塔宾曲霉、黑曲霉和阿姆斯特丹曲霉；除角膜曲霉和赤酵母发酵茶ECG含量显著升高外（P＜0.05），其他真菌发酵茶ECG含量极显著降低（P＜0.01）；除角膜曲霉外，其他8 种真菌发酵对CG含量均有显著影响（P＜0.05），其中黑曲霉极显著增加了CG含量（P＜0.01）。除赤酵母外，8 种真菌发酵茶总儿茶素含量显著下降（P＜0.05），减弱了六堡毛茶的苦涩味和刺激性。

2.2.4 不同茶样咖啡碱、总黄酮、游离氨基酸含量的变化

由表8可知，与CK相比，赤酵母发酵的六堡茶咖啡碱含量无显著变化，而其他8 种真菌发酵六堡茶的咖啡碱含量均显著增加（P＜0.05），塔宾曲霉、黑曲霉、芒果青霉、角膜曲霉、间型曲霉、团青霉、阿姆斯特丹曲霉发酵的六堡茶咖啡碱含量呈极显著增加趋势（P＜0.01）；其中塔宾曲霉发酵茶样咖啡碱含量最高，为（60.11±0.63）mg/g。与CK相比，9 种真菌发酵茶黄酮含量变化不同，黑曲霉发酵茶样黄酮含量极显著增加（P＜0.01），塔宾曲霉、芒果青霉、角膜曲霉、间型曲霉、阿姆斯特丹曲霉发酵样黄酮含量呈极显著减少趋势（P＜0.01），赤曲霉黄酮含量显著减少（P＜0.05）。9 种真菌发酵茶中游离氨基酸含量除阿姆斯特丹曲霉发酵茶显著减少外（P＜0.05），其他发酵茶样均极显著减少（P＜0.01），含量减少最多的是芒果青霉。

表8 单菌发酵对六堡茶主要化学成分的影响Table 8 Effect of single fungal fermentation on major chemical components in Liupao tea

3 讨论与结论

为探究20 株真菌固态发酵对六堡茶品质的影响，本研究利用人工接种固态发酵六堡毛茶，通过感官审评结果，挑选出9 株单菌发酵优异茶样进行理化成分分析。感官审评结果表明，与无菌发酵样CK相比，接种不同真菌发酵的茶样茶汤颜色加深，滋味由苦涩转为醇和或醇厚，香气由六堡毛茶的豆香、烟香转化为菌花香、木质香、陈香、甜花香。其中曲霉属对六堡茶品质影响最大，主要体现在茶汤上，曲霉属真菌发酵六堡茶汤色较其他属真菌发酵茶深，滋味更醇厚。综合各项指标显示，接种发酵21 d的六堡茶品质趋于稳定，角膜曲霉、间型曲霉、团青霉、阿姆斯特丹曲霉和赤酵母发酵21 d即可达到较优品质，香气表现为甜香带菌香，滋味醇厚。

理化成分分析结果表明，对比CK组，9 株真菌发酵茶样茶多酚、茶红素和可溶性糖含量均呈极显著变化（P＜0.01），总儿茶素含量方面除角膜曲霉和赤酵母发酵样外，其他真菌发酵与CK相比均极显著减少（P＜0.01）。茶褐素是黑茶中含量最高的一种色素类物质，其具有降血糖、降血脂[26-27]、促进胆固醇降解[28]、抑菌[29]、改善肠道菌群、抗氧化[30]、抗癌[31]等一系列特殊功效，本研究中9 株真菌发酵能使茶样中的茶褐素含量极显著增加（P＜0.01），其中黑曲霉在前人研究中已证实在一定条件下能高产茶褐素[32]。咖啡碱含量中赤曲霉发酵样显著增加（P＜0.05），赤酵母无显著变化，其他7 种真菌发酵均能极显著增加咖啡碱含量（P＜0.01），有研究表明曲霉属真菌在发酵过程中对茶叶中咖啡碱含量的增加有显著促进作用[33-34]。总之，塔宾曲霉、黑曲霉、团青霉和阿姆斯特丹曲霉发酵六堡毛茶能显著改变茶叶中18 种化学成分含量，感官审评结果显示塔宾曲霉和黑曲霉滋味品质不如团青霉和阿姆斯特丹曲霉，因此，本研究筛选出团青霉和阿姆斯特丹曲霉为最适单菌发酵菌株。