基于TLR4-NOD信号通路探究溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜修复和肠道自噬的影响

周广泉,李 堃,季 瑜

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是常见的慢性炎性疾病,可表现为腹泻和血便等。近年研究显示,UC在全球范围内发病率逐渐升高,已发展为一个影响全球人群健康的医疗难题[1]。UC发病机制和病因现尚不明确。虽有报道证明,其与遗传易感性、炎性损伤、自噬、肠屏障损伤和肠道菌群失衡等有关,但病程较长,易反复发作,治愈难度大,严重时可进展为结肠癌[2]。对UC西医主要采用免疫抑制剂和糖皮质激素等进行治疗,但由于存在较多不良反应、远期疗效差等原因,不能满足临床需要。随着现代中医的发展,中医治疗UC已显现出独特优势[3]。溃结灵由黄芪、制大黄、丝瓜络和珍珠粉组成,是我院季瑜主任治疗UC的经验方,在临床治疗UC方面具有明显效果。虽然已有研究显示,溃结灵可改善UC大鼠肠黏膜屏障,提高结肠组织抗炎能力[4-5],但该研究采用的溃结灵与我院溃结灵组方不同。Toll样受体4(TLR4)-核苷酸结合寡聚化结构域样受体(NOD)信号通路通过介导炎症反应参与多种炎性疾病发展,如UC[6]。目前,临床上关于我院溃结灵与TLR4-NOD信号通路对UC大鼠影响的研究未见报道。因此,本研究探究溃结灵通过调节TLR4-NOD信号通路对UC大鼠肠黏膜修复和肠道自噬的影响,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SD大鼠均购自江苏珂玛麒生物科技有限公司,生产许可证SYXK(苏)2021-0060,体质量180～220 g,6～8周龄,雌雄各半,所有动物在黑暗和光照周期各12 h,恒湿(50±10)%,恒温(23±2)℃下饲养,自由进食和饮水。本研究经海安市中医院医学伦理委员会批准(HZYLL2021-009)。

1.2 主要试剂

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)购于美国Sigma公司;D-乳酸(D-LAC)试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公司;二胺氧化酶(DAO)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)购自上海酶研生物科技有限公司;结肠组织自噬相关蛋白1(Beclin1)抗体、自噬相关基因5(ATG5)抗体、TLR4抗体、Toll样受体2(TLR2)抗体、NOD样受体蛋白3(NLPR3)抗体及内参β-actin购自英国Abcam公司。

1.3 溃结灵制备

组方为黄芪130 g、制大黄100 g、丝瓜络100 g、珍珠粉10 g,称取药材加10倍水煎煮1 h,过滤后药渣加5倍水煎煮1 h,过滤后合并滤液,水浴浓缩成含生药2 g/mL药液。成人用药3.6 g/d,体质量以60 kg估算,剂量为0.06 g/kg,根据转换公式和剂量系数计算出大鼠剂量为0.37 g/kg,低中高剂量按成人5、10、20倍计算,即1.85、3.70、7.40 g/kg。

1.4 动物建模

选择48只大鼠建立UC大鼠模型,具体参考文献[7],TNBS和乙醇溶液经灌肠法制备,大鼠禁食(不禁水)24 h,使用水合氯醛(10%)腹腔麻醉后,将100 mg/kg TNBS和0.25 mL乙醇溶液(50%)用改良版大鼠灌胃针缓慢注入大鼠距肛门7～8 cm肠腔内,注射结束后用手捏住肛门停留数分钟,防止溶液外漏,保证大鼠腹部呈上倾状态,注意大鼠保暖。另选取12只大鼠作为正常组,采用同样方法给予等量生理盐水灌肠。12 h后观察造模大鼠出现稀便和血便,表明建模成功。

1.5 动物分组

将48只建模大鼠分为模型组(UC组)和溃结灵低、中、高剂量组,每组12只。建模成功后正常组、UC组大鼠灌胃等量生理盐水,溃结灵低、中、高剂量组大鼠灌胃1.85、3.70、7.40 g/kg溃结灵,每日1次,连续12周。

1.6 病变活动指数(DAI)评分

末次灌胃24 h进行评估。DAI评分从体质量降低、大便形状和大便隐血或肉眼血便进行评估[8]。体质量下降:降低<1%计0分,1%～<6%计1分,6%～<10%计2分,10%～<15%计3分,≥15%计4分。大便性状:正常计0分,软便但成形计2分,软便不成形计3分,腹泻计4分。大便隐血或肉眼血便:正常计0分,轻度松散为阴性计1分,稀便但隐血阳性计2分,水样便但隐血阳性计3分,肉眼血便计4分。DAI=(体质量降低+大便形状+便隐血或肉眼血便)/3。

1.7 结肠长度和结肠黏膜损伤指数(CMDI)评分

末次给药后48 h麻醉脱颈处死大鼠,并进行解剖,取小鼠盲肠至肛门端结肠,铺在白纸上,直尺测量结肠长度。测量结束后,沿肠系膜侧线纵向剪开,经预冷磷酸盐缓冲液冲洗,滤纸吸干水分,平放白纸上,观察大鼠结肠损伤情况[9]:无损伤计0分,局部水肿但无溃疡计1分,有1处溃疡计2分,有2处溃疡计3分,有多处溃疡且长度累计<1 cm计4分,有多处溃疡且至少1处长度>1 cm计5分。

1.8 血清D-LAC、DAO及尿乳果糖(L)/甘露醇(M)检测

处死大鼠时取各组大鼠心脏血液5 mL,以3 000 r /min离心10 min后收集上清液,按照酶联免疫吸附试验试剂盒操作步骤检测血清D-LAC和DAO。各组大鼠末次给药后24 h,取L、M各2 mL灌胃大鼠,收集大鼠24 h尿液,以3 000 r /min离心10 min,取10 mL并加2 mL硫柳汞防腐(0.2 g/L),用高效液相色谱分析法检测L和M,计算尿L/M。

1.9 血清和结肠组织TNF-α检测

血清制备:处死大鼠时取各组大鼠心脏血液5 mL,以3 000 r/min离心10 min后取上清液;结肠组织制备:处死大鼠时取1 cm结肠(肛门2 cm处向上取结肠)组织,剪碎后制备匀浆液,经3 000 r/min离心10 min后取上清液。采用双抗体夹心法测定血清和结肠组织TNF-α。

1.10 Western blot法检测结肠组织Beclin1、ATG5、TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表达

处死大鼠时取大鼠结肠组织0.1 g制备各组大鼠结肠组织匀浆液,并加入蛋白裂解液,以BCA法对蛋白进行定量检测,将蛋白与上样缓冲液混合后,行12%凝胶电泳处理(每个槽孔内加40 μg),用半干法迅速转移至NC膜上,封闭培养1 h,加一抗Beclin1、ATG5、TLR4、TLR2、NLPR3及内参β-actin在4 ℃下过夜孵育,次日加HRP标记羊抗兔二抗室温下孵育1 h,最后加显色试剂用于显影、定影,凝胶系统拍照后,分析蛋白条带密度值。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况比较

实验过程中,正常组大鼠饮食饮水正常、体质量逐渐升高,且大鼠毛发光泽、活动敏捷,未出现稀便情况、肛门周围洁净;UC组大鼠食欲降低,出现懒动、精神萎靡,体质量降低,且出现血便、稀便等情况,大便松散;经过12周治疗后,溃结灵低、中、高剂量组大鼠随着药物剂量增加、治疗时间延长,饮食出现明显好转,体质量逐步增加,腹泻症状改善明显。

2.2 大鼠DAI评分结果比较

治疗1、2、6和12周,5组大鼠DAI评分总体比较差异均有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较,治疗1、2、6和12周UC组DAI评分升高;与UC组比较,治疗1、2、6和12周溃结灵低、中、高剂量组DAI评分降低;与溃结灵低剂量组比较,治疗1、2、6和12周溃结灵中、高剂量组DAI评分降低;与溃结灵中剂量组比较,治疗1、2、6和12周溃结灵高剂量组DAI评分降低(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠不同时间点DAI评分比较分)

2.3 大鼠结肠长度和CMDI评分比较

与正常组比较,UC组结肠长度缩短,CMDI评分升高;与UC组比较,溃结灵低、中、高剂量组结肠长度延长,CMDI评分降低;与溃结灵低剂量组比较,溃结灵中、高剂量组结肠长度延长,CMDI评分降低;与溃结灵中剂量组比较,溃结灵高剂量组结肠长度延长,CMDI评分降低(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠结肠长度和CMDI评分比较

2.4 大鼠血清D-LAC、DAO及尿L/M比较

与正常组比较,UC组血清D-LAC、DAO及尿L/M升高;与UC组比较,溃结灵低、中、高剂量组血清D-LAC、DAO及尿L/M降低;与溃结灵低剂量组比较,溃结灵中、高剂量组血清D-LAC、DAO及尿L/M降低;与溃结灵中剂量组比较,溃结灵高剂量组血清D-LAC、DAO及尿L/M降低(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠血清D-LAC、DAO及尿L/M比较

2.5 大鼠血清和结肠组织TNF-α比较

与正常组比较,UC组血清和结肠组织TNF-α升高;与UC组比较,溃结灵低、中、高剂量组血清和结肠组织TNF-α降低;与溃结灵低剂量组比较,溃结灵中、高剂量组血清和结肠组织TNF-α降低;与溃结灵中剂量组比较,溃结灵高剂量组血清和结肠组织TNF-α降低(P<0.05)。见表4。

表4 5组大鼠血清和结肠组织TNF-α比较

2.6 大鼠结肠组织Beclin1和ATG5表达比较

与正常组比较,UC组结肠组织Beclin1和ATG5表达减少;与UC组比较,溃结灵低、中、高剂量组结肠组织Beclin1和ATG5表达增加;与溃结灵低剂量组比较,溃结灵中、高剂量组结肠组织Beclin1和ATG5表达增加;与溃结灵中剂量组比较,溃结灵高剂量组结肠组织Beclin1和ATG5表达增加(P<0.05)。见表5和图1。

Beclin1为自噬相关蛋白1,ATG5为自噬相关基因5,UC为溃疡性结肠炎。

表5 5组大鼠结肠组织Beclin1和ATG5表达比较

2.7 大鼠结肠组织TLR4-NOD信号通路相关蛋白比较

与正常组比较,UC组结肠组织TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表达增加;与UC组比较,溃结灵低、中、高剂量组结肠组织TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表达减少;与溃结灵低剂量组比较,溃结灵中、高剂量组结肠组织TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表达减少;与溃结灵中剂量组比较,溃结灵高剂量组结肠组织TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表达减少(P<0.05)。见表6和图2。

TLR4为Toll样受体4,TLR2为Toll样受体2,NLPR3为NOD样受体蛋白3,UC为溃疡性结肠炎。

表6 5组大鼠结肠组织TLR4、TLR2和NLPR3蛋白表达比较

3 讨论

UC是炎性肠道疾病,肠道免疫炎症反应失衡和肠黏膜屏障损伤与UC发生发展密切相关[10]。现临床治疗UC多以西医为主,虽然可改善患者肠道屏障功能,并减轻炎症反应,但治疗后可在一定时间内复发[11]。中医将UC归为“痢疾”“泄泻”“肠癖”等范畴,多因脾胃虚弱、或饮食不节、或忧思恼怒等致脾胃损伤,蕴结于肠道,在肠道相互裹挟,致肠道传导失司、气血壅滞、肠络受损,下痢脓血、反复发作[12]。UC病位在肾、脾、大肠,病初多为湿热内蕴,肠道气机阻滞病久入络,久病入肾,而出现脾肾阳虚及寒热虚实夹杂之证,病机总属本虚标实[13]。本研究所采用溃结灵主要由黄芪、制大黄、丝瓜络和珍珠粉组成,黄芪可解毒排脓、利水消肿,制大黄可泻热通便、化瘀止血,丝瓜络可祛风通络,珍珠粉可养血安神、镇心定惊,诸药合用可共奏清热凉血解毒之功效。现代药理实验显示,黄芪主要成分黄芪多糖可改善UC肠黏膜损伤[14]。大黄中含蒽醌类化合物,含有蒽醌类成分的中药制剂在临床上广泛使用,以番泻苷、大黄酸和大黄素为主。已有研究报道显示,大黄酸对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎有明显缓解作用[15]。珍珠粉治疗UC效果也非常明显[16]。由以上论述可见溃结灵治疗UC效果确切。

本研究使用TNBS和乙醇溶液给大鼠灌肠,发现UC大鼠肠黏膜明显损伤,有明显血便、稀便、体质量降低等现象,且治疗不同时间大鼠DAI评分明显升高。CMDI评分、血清D-LAC和DAO及尿L/M是肠屏障功能受损常用标志物,正常情况下血清中D-LAC和DAO含量较少,尿L/M较低,若肠道出现明显损伤可促进血清D-LAC、DAO和尿L/M值升高[7]。本研究发现,不同剂量溃结灵灌胃UC大鼠后,可明显降低不同时间DAI评分,并降低CMDI评分及血清D-LAC、DAO和尿L/M,这与王慧等[7]研究结果相似。可见溃结灵可明显改善UC大鼠肠黏膜屏障功能,有助于肠黏膜修复。

炎症反应在UC病理机制中起关键作用,表现为促炎性因子和抗炎性因子释放失衡,造成TNF-α等因子分泌增加,加重肠黏膜损伤程度[17]。目前,有研究报道,自噬功能障碍可破坏肠道稳态、影响肠道微生物及促进炎症反应等,进一步加重肠道黏膜损伤[18]。Beclin1、ATG5是常用自噬相关蛋白或基因,前者是自噬自动蛋白和基因,后者可参与自噬小体合成,对自噬形成起决定作用[19]。本研究结果显示,UC组血清和结肠组织中TNF-α释放明显增加,Beclin1、ATG5表达减少,经过不同剂量溃结灵灌胃后可降低血清和结肠组织TNF-α,增加Beclin1、ATG5表达。表明溃结灵可改善UC大鼠炎症反应和肠道自噬。

TLRs和NOD为模式识别受体关键蛋白家族,通过介导炎症反应参与疾病进展,TLRs家族成员中TLR4、TLR2是常见因子,TLRs可通过感知病原体中分子模式参与免疫炎症反应。已有研究报道,TLR4、TLR2在肠黏膜损伤组织中高表达,可通过激活核因子-κB通路、NLRP3炎性小体活性,进而加重结肠炎肠道炎症反应[20]。本研究发现,UC组结肠组织TLR4、TLR2、NLPR3蛋白表达增加,溃结灵可呈剂量效应关系减少TLR4、TLR2、NLPR3蛋白表达,与上述报道相符。说明溃结灵对UC大鼠炎症反应、肠道屏障功能等作用可能与调节TLR4-NOD信号通路有关,但具体作用机制尚不清楚,有待进一步探究。

综上所述,溃结灵可改善UC大鼠肠黏膜屏障功能、肠道自噬,并减轻体内炎症反应,有利于肠黏膜修复,其作用机制可能与TLR4-NOD信号通路有关,其中高剂量溃结灵效果最为明显。