微波场中蛋白质-淀粉可食薄膜结构特性分子动力学研究进展

杨瑞炳，税小林，梁 珊，毛伟杰，刘书成,2，魏 帅,2,*

（1.广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋生物制品工程实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心，水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088；2.大连工业大学海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034）

蛋白质在自然状态下以球状或纤维状存在，可生物降解，其物理和化学性质取决于氨基酸残基的相对数量和在多肽链上的位置，适用于制造新型复合材料和混合材料[1]。根据化学结构的不同，蛋白质分为乳清蛋白（Ovalbumin，OVA）、锌蛋白、大豆蛋白及卵清蛋白等，其所制作的薄膜广泛应用在水果、蔬菜、坚果、肉类、预制甜点、奶酪片等[2]。OVA 属于球状蛋白，具有三级结构和球形，可因加热、高压、酶促反应、振荡、pH值变化等而变性[3]。OVA 成膜特性较好，但纯OVA制备的薄膜机械性能和阻隔性较差，需要络合其他配体或进行物理、化学、酶法改性以提高其性能[4]。淀粉是一种可生物降解的聚合物，包括两种初级聚合物（直链淀粉和支链淀粉）。淀粉膜的理化性质与其一级结构、二级结构、分子链相互排列、分子取向及累积的三级结构或晶体结构有关，在成膜过程中，淀粉链的取向有利于提高淀粉膜的机械强度和阻隔性能[5]。Wang 等[6]研究表明，较高的分子取向容易诱导重结晶和形成有序的晶体结构，可增强淀粉薄膜的功能特性。Shah等[7]研究发现，辛烯基琥珀酸是木薯淀粉分子链上的两亲基团，决定了木薯淀粉分子具有亲水性和亲脂性。单一的淀粉薄膜具有高亲水性和吸湿性，但不具备高拉伸强度，在环境中易腐烂和变形，成膜时需搭配其他原料[8]。将生物聚合物进行混合后开发新的或具有特定功能的生物聚合物材料，是平衡或扭转物料自身缺陷的有效途径。如将松果木质素按照一定比例与蚕豆蛋白混合后制备的薄膜，其断裂伸长率、热稳定性、水汽阻隔性均显著提高，木质素和蛋白质分子间的相互作用，有效降低了薄膜中的水分含量[9]。利用油酸（OA）与纳米晶纤维素（NCC）相互作用制备的OA-NCC 复合薄膜，抗拉强度和断裂伸长率显著提高，薄膜内聚性得到加强[10]。OVA和小麦淀粉混合，可形成新的结晶区域，其能有效改善所制作产品的硬度、咀嚼性、回弹性、抗剪切性等质构特性，提升持水能力的同时降低体外消化率[11]。在蛋白质和淀粉构成的二元混合物中，生物聚合物之间的相容性决定了混合物的稳定性。若混合物之间不具备热力学相容性，则可能发生相分离形成新的微观结构，复合材料功能特性也将受到影响，表现在热加工、化学作用或机械作用过程中，复合材料分子网络破裂或基质的重组，材料中亲水性或疏水性化合物从基质中迁移和释放，进而造成复合材料功能特性改变[12]。

微波加热食品具有便捷高效的特点，将食物置于微波电场时，在离子传导机理中，正离子向电场方向移动，负离子向相反方向移动，场的方向改变致使离子来回移动，食物中含有的极性分子（如水）会产生偶极振动和旋转，伴随着剧烈的撞击与摩擦，进而使食品升温[13]。微波加热直接作用于食品内部，且主要是微波场对食品物料中极性分子的作用，因此极性分子的自身介电特性及数量是影响食品中传热和传质的重要影响因素。介电特性为静电在电场中的节能和损耗性质，通常表示为介电常数（ε′）和介电损耗（ε″）；食物介电特性的影响因素有很多，如成分（水和盐含量）、密度、温度、频率和储存时间[14]。

蛋白质和淀粉原料拥有不同的缺点与优点，但两者配合形成的二元混合物却可以在特定使用场景中弥补各自的缺点，蛋白质-淀粉薄膜就是很好的例子。将薄膜置于微波环境中，微波对薄膜的作用效果除去设备本身功率等因素后，主要与薄膜的含水量、极性基团数量、静电作用力、范德华力、化学键能大小等相关[15]。然而这些研究超越了人肉眼直观感受的范围，无法用肉眼观察。分子动力学（Molecular dynamics，MD）模拟经过不断发展，在分析蛋白质构象变化及其动力学机理方面发挥了重要作用。MD技术依托牛顿力学理论，以物质的微观结构系统反映宏观特征，其在分子结构体系表征上的独特优势，为理解组分间构象变化和分子间作用力变化提供了关键信息[16]。食品领域中的MD 模拟（如蛋白质-淀粉薄膜材料）往往需涉及数以万计分子量的大分子模拟，这阻碍了更高性能、更具特色的蛋白质-淀粉薄膜的开发与应用。因此，本综述以蛋白质-淀粉薄膜研究为引，总结了MD 模拟技术在蛋白质-淀粉薄膜结构特性研究中的应用进展，重点以微波加热为处理手段，以期为蛋白质-淀粉薄膜材料的开发提供参考。

1 MD模拟技术

1.1 经典MD技术的起源与发展

分子动力学的起源与发展历程有三个重要阶段：第一阶段是Alder 和Wainwright 基于刚球势提出的一种模拟方法，其核心理念是采用电子计算机求解多体运动的方程；第二阶段是Rahman 利用Lennard-Jones 势（又称L-J 势、6-12 势、12-6 势）函数法对液态氩性质的模拟，其解析式简洁高效，尤其对惰性气体分子间相互作用力的计算精确；第三阶段是第一性原理分子动力学法（FPMD）的建立，在这个算法中，经典动力学的常数可在试验中获取或以函数进行拟合，最终绕开繁琐的计算过程[16]。分子动力学模拟、量子模拟、大颗粒模拟有着本质的区别（如图1A所示），在模拟过程中涉及许多复杂的分子势能模型（图1B）。基于刚球势求解多体运动方程早期出现在各种非平衡现象所伴随的弛豫现象研究，利用电子计算机精确求解数百个粒子的经典运动方程，其确定了系统中被处理粒子的周期性边界条件，初始粒子出发于有序晶格内，运动方向随机，但速度和大小统一[17]。Lennard-Jones 势函数法则是基于两粒子中心力相互作用的经典动力学计算方法。该方法需要依据现实条件假设相互作用势被截断到一定范围外，体系中的粒子数量必须很小，同时需要施加系统边界条件。最后，运动方程还必须作为一组差分方程来求解，这个方程涉及从一组速度和位置到下一组速度和位置间一定时间的增加量[18]。FPMD 法也叫“从头算动力学”，可根据原子核和电子相互作用的原理及其基本运动规律，经过多个近似处理后直接求解薛定谔方程，进而得到材料几乎所有的基态性质[19]。在FPMD 方法之后巨正则系综蒙特卡罗法（Grand canonical monte carlo，GCMC）被提出，并在蛋白质、脂肪、碳水化合物等大规模分子系统中成功应用[20]。

图1 常见模拟方法（A）和MD模拟过程中常见的分子势能模型（B）Fig.1 Common simulation methods(A)and molecular potential energy models in MD simulation(B)

1.2 现代分子动力学的发展

现代MD 技术核心依托牛顿运动方程以及相关作用势进行演化，在现代计算机和超算技术及相关软件技术的支持下迅速发展，模拟方向有：①大体系的局部精确模拟，用以实现不同水平的计算方法同时进行的方法，将对体系划分为高层、中层和底层区分计算，在降低计算成本的同时得到可靠的几何结构以及能量，可应用于生物分子、过渡金属配合物和催化等领域[21]；②对相空间中的特定状态进行研究，演化出的方法是“增强采样动力学”，其可用以解决常规采样效率低且易陷入局部极小值问题，广泛应用于蛋白质构象变化及计算相应的自由能变化研究[22]；③克服经典动力学不能模拟成键或断键反应，诞生了反应力场动力学，以解决经典力场模拟过程中化学键的固定问题，其时间尺度和空间尺度计算介于经典MD 力场计算与量子力学计算之间；④对MD 模拟过程中特定区域分子施加额外受力研究，并且促生了拉伸动力学，用于考察外力作用下目标分子解折叠或分子复合物解离过程中的构象动态变化。

1.3 MD模拟步骤

MD 模拟结合了物理学、化学及数学计算方法，通过牛顿第二定律演化得到相应运动方程，可以在物理定律(包括量子和经典力学理论)的影响下，模拟特定时间段内分子之间的相互作用，它被认为可以直接洞察聚合物基系统的分子相互作用和能量状态[23]。MD模拟一般分4步，如图2所示。其中又细分构型、力场和模拟软件选择、构建体系与能量最小化、平衡、结果分析。构型是模拟前提，试验数据或量子化计算是构型主要来源，如X 射线衍射分析、核磁共振波谱法测定及已知分子结构的同源建模得到目标分子结构信息（键、角、扭转角、Lennard-Jones 相互作用及静电相互作用）[24]。构型完成后需要依据模拟体系特性选择适宜的力场和模拟软件，而软件选择通常是依据力场而定（表1）。

表1 MD模拟常用软件及信息Table 1 Common software and information for MD simulation

图2 YASARA软件MD模拟步骤示意图Fig.2 Schematic diagram of YASARA software MD simulation steps

依照研究对象所处的环境（如气相、溶液或跨膜环境）构建模拟体系，同时运用最陡下降法和共轭梯度法将体系能量最小化，以解决初步构型体系中产生的相邻原子间隔过近问题。体系完成后的分子应当依据玻尔兹曼分布指定原子初始速度，并调整体系到任意方向的动能之和为零，此时MD体系温度恒定，以保证体系无平动位移[34]。经平衡相的体系进行模拟时，体系中的分子和原子依照构型状态进行吸引、排斥、碰撞运动，引入牛顿运动方程及预先给定的粒子间相互作用势计算分子内部的势能和动能转换，得到粒子坐标、速度及能量（静电能、范德华能、体系动能、势能及总能量）随时间变化的运动轨迹，待体系再次平衡后可产生抽样样本[35]。通过MD 模拟软件分析从系综平均中得到的可与试验结果相比较的物理量[36]，常用的分析方法包括：①平均能量及其涨落随模拟时间的变化；②体系平均原子坐标及其涨落随模拟时间的变化；③计算体系的结合自由能；④由几何判据分析分子内及分子间的氢键结构及其氢键占有率；⑤蛋白质二级结构及其随时间变化；⑥计算体系的动力学性质[37-38]。

2 微波场中蛋白质和淀粉的响应及MD 模拟应用

2.1 蛋白质在微波场中的响应及MD模拟应用

微波加热（MH）被称为第二火焰，在蛋白基食品加工中被广泛应用，微波与物料组分间存在相互作用，但作用机理尚不清晰，尤其是蛋白质分子与微波间的相互影响关系难以确定。MH属于体积加热，传统加热为从表面到核心，两者在传热方式及传热效率上存在巨大差异。MH存在热效应和非热效应，对蛋白质溶解性、起泡性、乳化性、凝胶性、消化特性等存在改性作用[39]。MH 可促进蛋白质降解，如木瓜蛋白酶样品中蛋白质的水解，MH会引发蛋白质结构中亚基位移，改变蛋白质的结构特征[40]。MH 可以利用非热效应促使牛β-乳球蛋白（β-Lg）结构的展开，三级结构损失高于传统加热，对β-Lg 中埋藏酰胺基团的热展开和暴露具有显著增强作用[41]。Yoshida 等[42]研究显示，微波可令分子扰动或影响分子转运。依据MH 的核心原理，微波场中的分子能受微波场影响，相关分子必定表现出极性。如蛋白质中的氨基酸基团属于带正电的极性基团，MH形成的磁场会使极性分子运动和转动，引起分子摩擦导致物料升温[43]。因此，MH 引发的热效应会导致对温度敏感的蛋白质发生结构变化、展开和聚集效应。在蛋白质对微波的响应研究中，低水合卵清蛋白中卵清蛋白的低频响应表现出异常的介电行为，其中实数和虚部介电常数平行，并向低频急剧增加，也被称为低频色散（LFD），这可能是质子通过蛋白质基质的准直流渗透，且蛋白质在大分子尺度上发生了质子跳跃[44]。Xie等[45]的研究结果支持蛋白质在MH中发生的大分子跳跃现象，同时指出，跳跃可能发生在可电离的两条侧链之间，且属于短程电荷跳跃。在蛋白质对MH的响应中，蛋白质骨架的灵活性，结合水和表面水合水的重新定向极化也可对响应程度产生影响，其在某种程度上取决于蛋白质中水分含量及水合水与蛋白质间的特定相互作用[46]。MD模拟参与的蛋白研究中可以提供条件变化后蛋白质与相关底物在特定条件下反应一段时间（通常为皮秒（ps）或纳秒（ns））后，体系中各组分原子分子的位置信息、静电作用力、范德华力、键角键能等关键信息。Eremenko等[47]在人血清蛋白（HSA）、H2O、NaCl、葡萄糖组成的NaCl-HSA水溶液体系及葡萄糖-HSA 水溶液体系中成功运用MD模拟得到了试验中难以观察的键能、成键主要作用力、氢键、体系能量等信息。如图3A所示，MD模拟展现了经过一定时长（80 000 ps）的动力学反应后，NaCl-HSA 水溶液体系和葡萄糖-HSA水溶液体系的氢键数、氢键寿命、体系分子或离子的相对空间位置及数量，同时验证了两种溶液体系介电特性变化的关系。Wang等[48]则运用MD模拟了肌球蛋白-庚醛体系（图3B），并且分析了模拟体系中均方根偏差（RMSD）、均方根波动值（RMSF）、分子动力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）平均自由能、单个残基对肌球蛋白-庚醛复合物结合自由能的贡献；与试验结果相互验证后表明，疏水相互作用是醛类可逆结合的主要驱动力，有助于肌球蛋白-庚醛体系的稳定性。Wang等[48]的研究虽然不像Eremenko等[47]的研究涉及MH 条件或体现MH 特性，但却从MD 模拟含蛋白质体系的方法入手，为研究者解释了微观物质及能量变化信息，这些RMSF、体系能量、自由能、氨基酸残基等信息是传统试验数据无法获取的。

图3 蛋白质、淀粉及蛋白质-淀粉体系MD模拟案例[47-48,51,55]Fig.3 The protein,starch and protein-starch system simulated using MD[47-48,51,55]

2.2 淀粉在微波场中的响应及MD模拟应用

微波可以直接或间接地诱发淀粉颗粒形态和内部结构的一系列变化，其与体系的介电特性和微波能量密度紧密相关。淀粉属于高分子聚合物，在微波场环境中主要受到电子、原子、偶极和界面4 个极化分量中偶极极化的影响，MH不会引起官能团的产生与消失[49]。由于淀粉的长链分子结构和精致的空间结构，淀粉的极化现象并不明显，使得淀粉的介电参数较低，但体系中混合水等极性分子后，淀粉基材料的介电特性会显著变化[13]。淀粉材料的介电特性与其他特性的相关可用于预测体系中某成分的含量，如可溶性固形物含量的预测。Kubo 等[50]研究表明，可溶性固形物中糖的含量与其介电性能之间存在非线性关系。蔗糖、葡萄糖、果糖等糖溶液与其介电特性的关系也有相关报道：ε″随温度以二次方相加，而随葡萄糖浓度线性降低，在较低温度下，ε″随浓度线性增加，达到一定浓度后降低，在高于40 ℃的温度下，损耗因子在所研究的所有浓度范围内随浓度线性增加；而在水溶液中，单糖（D-果糖和D-木糖）和双糖（D-麦芽糖-水合物）的混合物成分对ε″和弛豫时间影响显著，同时通过分子间相互作用分析以及活化焓证实D-果糖的水溶液比D-木糖和D-麦芽糖的水溶液有更强的相互作用[13]。Liu 等[51]借助MD 技术对热处理和压力处理条件下的玉米淀粉分子结构进行了对比（图3C）。MD 模拟提供的分子氢键和体系能量变化信息支持高静水压处理减少淀粉中固化水和提升水分子自由度的结论。通过可视化高静水压处理引发淀粉糊化过程中键合能量的变化数据，为淀粉研究提供了有益的参考。

2.3 蛋白质-淀粉薄膜在微波场中的响应及MD 模拟应用

将蛋白质和淀粉进行二元混合并通过相关条件制备成蛋白质-淀粉薄膜后，蛋白质-淀粉膜体系对微波场的响应不是蛋白质对MH 响应与淀粉对MH响应效果的叠加。在复杂的蛋白质与淀粉的缔合或络合过程中，键的生成和断裂将蛋白质和淀粉的原子或分子进行了重新排列组合，在不考虑水等溶剂的影响下，微波场中蛋白质-淀粉薄膜的介电特性变化主要由薄膜中的偶极子密度和强度决定[52]。然而蛋白质-淀粉薄膜在完全无水时表现出极强的脆性且易碎裂，所以蛋白质-淀粉薄膜中需含有一定量的水。当薄膜中有水存在时，水本身具备较强的ε′和ε″，且可以促进蛋白质的溶解。此外，水的存在还会使薄膜材料中的极性基团（如淀粉中的-OH基团）或带电粒子具有更强的流动性，进而增加单位空间内电荷载流子的数量和粒子间碰撞几率，促进ε′和ε″值增大；蛋白质-淀粉薄膜的介电响应特征在考虑偶极子基础上还需要考虑界面极化的影响[53-54]。

借助MD 模拟技术或许能将薄膜中的蛋白质和淀粉分子结构特征可视化，且通过牛顿运动方程、Lennard-Jones 势函数及其他作用函数，薄膜中的偶极极化和界面极化机制也将得到更为直观的解释。Chen 等[55]在羟丙基淀粉-玉米醇溶蛋白双层食用薄膜研究中成功应用了MD技术，如图3D所示，其在模拟过程中发现初始时玉米醇溶蛋白只体现出聚集性的变化，螺旋状的淀粉在水溶液中逐渐松弛并裂解，随后淀粉和玉米醇溶蛋白发生了键合，在这个过程中氢键的作用促使淀粉和玉米醇溶蛋白的基团暴露于表面。Man 等[44]研究表明，在MH 中被显著影响的淀粉基团是-OH，而蛋白质基团对应的可能是-NH2。因此，同样可以借助MD 技术将蛋白质-淀粉薄膜的偶极极化和界面极化的信息进行可视化。

3 小结

蛋白质与淀粉具备形成结构更好的可食薄膜的潜力，近十年，二者的相关研究较多。可食膜对食品保鲜、抗机械损伤及提升食品加工性能非常重要，其研究涉及原子与分子层面动态变化的影响，为多学科交叉。食品在MH条件下，材料基的极性分子片段或极性大分子基团会受到微波的影响；然而原子及分子层面的微观变化不仅速度极快，还无法被肉眼观测到，严重阻碍了蛋白质-淀粉基薄膜材料的开发与应用。MD模拟将原子、分子可视化，且能提供氢键作用力、静电作用力、范德华力、库仑力及微观化学键键能及其他信息，同时MD能清晰给出假设条件下的分子结构预测信息，为相关研究提供了新的技术途径。