基于网络药理学分析羌活的药理作用机制

万亭君

(西南民族大学民族学博士后科研流动站,成都 610041;新华文轩出版传媒股份有限公司博士后科研工作站,成都 610036)

0 引言

羌活NotopterygiuminchumTing ex H,T- Chang是一种伞形科植物的干燥根茎和根,又名护羌使者、羌青、胡王使者、退风使者等,在《中国药典》中记载其味辛、苦,性温,归膀胱、肾经,具有解表散寒、祛风除湿、止痛的功效[1]。羌活传统产区主要是藏族、羌族和其他少数民族聚居的高寒山区[2],是中、藏、羌医药体系常用药物,具有悠久的药用历史和广泛的应用范围。现代药理研究表明,羌活具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、解热镇痛等作用,对心脑血管系统、消化系统、呼吸系统和中枢神经系统有显著影响[3]。网络药理学为中药研究带来了新的技术与方法,推进了药物发现、开发和治疗机制的理解过程,其系统性、整体性的研究理念与中药复方多组分、多功效、协同作用等特点不谋而合,在中药药理机制研究、新药发现及不良反应研究等方面取得了良好成效[4]。本研究为拓展羌活的现代药理学内涵,选用网络药理学方法对其药理成分进行筛选、分析,以期为更有针对性地深入探索其药理机制奠定基础。

1 研究方法

1.1 数据库的选择

中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)、中药系统药理学分析平台(TCMSP)、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction、通用蛋白质知识库(Uniprot)、String 11.5、DAVID 6.8生物信息学资源。

1.2 优效化合物的筛选

通过TCMSP检索羌活的所有化学成分,设置化合物口服生物利用度(OB)阈值为≥30%,设定化合物类药性(DL)阈值为≥0.18,获得羌活的优效化合物。

1.3 化合物靶点的预测

将羌活的优效化合物分别输入TCMSP、BATMAN-TCM、STITCH 5.0、SwissTargetPrediction检索成分靶点,合并、删除重复靶点,再应用Uniprot数据库转换靶点蛋白名为基因名。

1.4 化合物-靶点网络的构建

应用Cytoscape 3.9.1将筛选出的优效化合物和预测得到的靶点基因进行可视化呈现,构建化合物—靶点网络。

1.5 蛋白质间相互作用(PPI)网络的构建

在String 11.5数据库中导入筛选所得的优效化合物对应的靶基因,设置最低相互作用分数要求为0.900,获得靶点间的相互作用网络,进一步应用CytoHubba分析获得排名前10的核心基因。

1.6 基因本体论(GO)功能富集分析

将筛选出来的靶基因输入DAVID数据库进行GO功能富集分析。

2 结果

2.1 优效化合物的筛选

通过TCMSP检索羌活的所有化学成分,共得到185个化学成分,阈值设定OB≥30%,DL≥0.18,结果共筛选出羌活优效化合物15个(表1)。

表1 羌活优效化合物筛选

2.2 化合物-靶点作用网络的构建

通过TCMSP检索获得相关靶点,合并上述优效化合物输入至BATMAN-TCM、STITCH、SwissTargetPrediction获得的靶点,共检索得到170个靶点蛋白,通过Uniprot数据库转换基因后应用Cytoscape 3.9.1构建化合物-靶点作用网络(图1)。图中共有183个节点,包含13个化合物节点、170个靶点节点、246条连接线。圆形节点代表靶点,菱形节点代表化合物,连接线代表化合物-靶点的相互作用。图中可见有多处同一靶点与不同化合物之间存在关联,进一步印证了中药多成分、多靶点的特点。

图1 羌活优效化合物-靶点作用网络Fig.1 Notopterygiuminchum compound-target action network

2.3 羌活靶点的PPI网络构建与核心基因的获得

以“置信分数≥0.900”作为条件构建羌活靶点PPI网络图(图2)。图中有128个节点、560条边,其中节点表示靶点,边表示靶点与靶点之间的相互作用关系。应用Cytoscape 3.9.1将数据进行可视化呈现,进一步采用MCODE模块,以“score cutoff =0.2、 k core=2、 maximum depth = 100和degree cutoff=2”为条件进行聚类分析,共获得9个子网络,取分值最高的前5个聚类(图3)。应用Cytohubba对网络中的节点进行排名,通过MCC的拓扑学分析方法获得排名前10的核心基因网络(图4)。

图2 羌活优效化合物靶点PPI网络Fig.2 Notopterygiuminchum compound target PPI network

图3 聚类分值前5的子网络Fig.3 Subnetworks of top 5 cluster

图4 排名前10的核心基因网络Fig.4 Top 10 core gene networks

图3a～图3e依次为分值降序的聚类子网络。

2.4 羌活靶点的GO分析

将数据导入DAVID 6.8数据库,对羌活靶点的生物过程、细胞成分和分子功能进行富集分析,按照显著性程度P<0.01获得了GO条目333条,靶点涉及的生物过程条目有200条,细胞成分43条,分子功能90条。其中,生物过程主要富集在对药物的反应、外源代谢过程及对外源刺激的反应等;分子功能主要富集在RNA聚合酶II转录因子活性、配体活化序列特异性DNA结合、血红素结合及细胞色素-c氧化酶活性等;细胞成分主要富集在线粒体呼吸链复合体Ⅳ、线粒体和大分子复合体等。

3 讨论

现代药理学研究发现,羌活具有抗心律失常、抗肿瘤、抗缺血缺氧、抗血栓、调节中枢神经、抗氧化、抗炎、镇痛、抗菌及抗病毒等作用[5]。为进一步阐释羌活的药理作用机制,利用网络药理学方法,基于筛选出的羌活的优效化合物构建化合物-靶点网络和PPI网络进一步对靶点进行基因本体的功能注释,为羌活优效化合物的多靶点、多功效药理作用机制提供研究基础。

研究证实,香豆素糖苷、达莴瑟苷、羌活酚等香豆素类化合物是羌活发挥抗炎、抗氧化应激损伤等作用的有效成分[6]。羌活的甾体类化合物,如谷甾醇、β-谷甾醇也表现出广泛的药理活性,如抗炎、降血脂、抗肿瘤、抗血栓[7]等。此外,香叶木素等羌活的黄酮类化合物被证实有强烈的抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病及调节免疫作用[8]。

香豆素类化合物是羌活中主要的非挥发性成分,也是发现最早、最多的一类成分[9],该结论与TCMSP数据库筛选出来的分子靶标基本一致,说明通过网络药理学筛选的羌活主要分子靶标的准确性较高。

研究共预测得到羌活优效化合物的靶点183个,进一步将其进行PPI分析得到排名前10的核心基因,从化合物-靶点网络可以推测,羌活对疾病的治疗或调节作用可能通过优效化合物与关键靶点之间的相互作用而发挥。

这10个核心基因均为细胞色素c氧化酶的组分,驱动氧化磷酸化[10]。研究显示,COX6B1具有增强能量消耗、抑制脂肪生成的作用[11]。COX7C对线粒体蛋白质组的维持和线粒体功能的稳定至关重要[12]。COX6C表达的变化在心血管疾病、肾脏疾病、脑损伤和肿瘤中都广泛存在[13]。COX5A具有减少心肌细胞死亡并促进心脏恢复的作用[14],具有保护皮质神经元受到缺血缺氧损伤的作用[15]。COX4I1具有预防短暂性局灶性脑缺血损伤的作用[16],并与肥胖和2型糖尿病相关[17]。MT-CO1与肿瘤[18]、发生新心血管事件风险相关[19]。COX5B通过自噬途径协调以平衡抗病毒信号传导活性[20],与脓毒症有着显著关联[21]。研究证实,其与年龄依赖性肥胖相关[22]。MT-CO2的表达与肿瘤预后[23]、冠状动脉性疾病[24]相关。COX7B与癌症的化学敏感性和耐药性相关[25]。COX8A与脂质代谢[26]、肿瘤相关[27]。

应用网络药理学方法初步探索了羌活的优效化合物、关键靶点、核心基因等,既验证了羌活的传统药理学作用,又有助于羌活潜在药理作用和作用靶点等的挖掘,下一步还可对羌活的优效单体成分进行深入研究,为新药开发、成药优化、临床阐释等提供数据支持和研究基础。