长链非编码RNA IGF2BP2-AS1通过调控miR-375表达对喉癌细胞迁移及增殖的影响

王挺 张杨 郭洁 范崇盛 刘亚芳

1郑州大学附属洛阳中心医院耳鼻咽喉头颈外科，洛阳 471000；2吉林大学第一医院肿瘤科，长春 130061

喉癌是全球常见的咽喉部恶性肿瘤，其发病通常较隐匿，确诊时可能已发生转移［1-2］。喉癌的发生和发展涉及多种基因、多种信号通路的改变，特别是表观遗传基因的表达异常［3］。因此，探究喉癌发生发展的基因调控机制，有助于寻找新的治疗靶点。长链非编码RNA（lncRNA）是一类内源性小分子RNA，参与调控染色质的结构变化、基因转录、基因翻译过程［4-6］。lncRNA 作为一种非编码RNA，被证实在喉癌、前列腺癌、肝癌等恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤细胞的分化、放化疗敏感度以及患者预后密切相关［7-10］。胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白2（IGF2BP2）-AS1 是新发现的一种lncRNA，其在多种肿瘤（如膀胱癌、口腔鳞状细胞癌等）中高表达，表现为明显的癌基因功能［11-12］。IGF2BP2-AS1在喉癌细胞中的表达及对喉癌细胞的调控机制 并 不 清 楚 。本 研 究 以 IGF2BP2-AS1/微RNA-375（miR-375）轴为切入点，探究IGF2BP2-AS1 对喉癌细胞增殖、迁移的影响及分子机制，以期为喉癌的诊疗提供新策略。

材料与方法

研究时间为2022年1月至2023年11月，研究地点为郑州大学附属洛阳中心医院中心实验室，研究类型为基础研究。

1.细胞系和主要试剂

支气管上皮细胞系16HBE 和喉癌细胞系AMC-NH-8、TU159、TU138、TU686 购自北京索莱宝科技有限公司。胎牛血清和DMEM 培养基购自美国Gibco 公司。阴性对照RNA 和IGF2BP2-AS1 小干扰RNA 购自武汉益普生物科技有限公司。miR-375、miR-NC 购自上海恒斐生物科技有限公司。Lipofectamine 3000、CCK-8 试剂盒购自美国Invitrogen公司。SYBR试剂盒、双荧光素酶活性试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。双荧光素酶载体购自北京智杰方远科技有限公司。兔源N-钙黏着蛋白（N-Cadherin）、叉头框蛋白C2（FOXC2）、β 肌动蛋白（β-actin）、CDK2、细胞周期蛋白A（Cyclin A）一抗抗体购自美国Sigma公司。

2.细胞培养和分组

恒温箱参数设置为37 ℃、5%CO2，AMC-NH-8、TU159、16HBE、TU138、TU686 均用含12%胎牛血清的DMEM 培养基培养。将对数生长期的TU686 细胞接种在12 孔板，TU686 细胞分为si-NC 组和si-IGF2BP2-AS1 组，分别采用Lipofectamine 3000 转染试剂将阴性对照RNA 和IGF2BP2-AS1 小干扰RNA 转染到TU686 细胞，转染45 h后进行后续实验。

3.实时荧光定量PCR（qPCR）检测细胞中IGF2BP2-AS1、miR-375表达

采用Trizol法提取各细胞系的总RNA，进一步反转录为cRNA。按照SYBR 试剂盒说明书设置qPCR 反应体系，以GAPDH 为内参比较IGF2BP2-AS1 表达量，以U6 为内参比较miR-375 表达量，引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算IGF2BP2-AS1、miR-375相对表达量。

表1 qPCR引物序列

4.CCK-8 法检测敲降IGF2BP2-AS1 后TU686 细胞的增殖能力

收集转染后的各组TU686 细胞，分别以3×103个/孔接种于96孔板，在恒温箱内持续培养1、2、3、4、5 d。每天固定时间分别向各孔加40 μl的CCK-8试剂，恒温箱内处理2 h。采用全自动酶标仪测量各孔TU686细胞在450 nm处的吸光度（OD）值。

5.划痕愈合实验检测敲降IGF2BP2-AS1后TU686细胞的迁移能力

收集转染后的各组TU686 细胞，用含15%胎牛血清的培养基重悬。调整细胞密度后，分别将TU686 细胞加入24孔板，培养24 h。PBS溶液清洗3次，用10 μl移液枪吸头在24 孔板底划痕，PBS 溶液清洗3 次，加入1 ml 不含胎牛血清的培养基，在光学显微镜下观察、拍照，测量划痕宽度P1。培养24 h 后，PBS 溶液清洗3 次，加入1 ml 不含胎牛血清的培养基，在光学显微镜下观察、拍照，测量划痕宽度P2。TU686细胞划痕愈合率=（P1-P2）/P1×100%。

6.双荧光素酶报告基因实验验证IGF2BP2-AS1 与miR-375的靶向

分别构建IGF2BP2-AS1 野生型质粒IGF2BP2-AS1-Wt和突变型质粒IGF2BP2-AS1-Mut，采用Lipofectamine 3000 试剂分别将IGF2BP2-AS1-Wt、IGF2BP2-AS1-Mut 与miR-NC 或miR-375 转染到TU686 细胞。转染45 h，利用双荧光素酶检测试剂盒检测TU686细胞的海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，分析各组TU686 细胞的荧光素酶活性。

7.Western blotting 检测TU686 细胞中N-Cadherin、FOXC2、CDK2、Cyclin A蛋白表达

采用RIPA 裂解液提取转染后TU686 细胞的总蛋白，蛋白变性后经聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转到硝酸纤维素膜，经10%牛血清白蛋白封闭50 min。加入一抗N-Cadherin（1∶2 000 稀释）、FOXC2（1∶3 000 稀释）、CDK2（1∶4 000 稀释）、β-actin（1∶4 000 稀释）、Cyclin A（1∶4 000 稀释），在4℃孵育8 h。经TBST 溶液清洗后，加入二抗羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）抗体（1∶7 000稀释），在25 ℃孵育50 min。经TBST 溶液清洗后，采用化学发光法曝光并显影。

8.统计学方法

所有实验均独立重复4 次。用SPSS 22.0 软件统计数据，用GraphPad 7.0软件绘图。呈正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.IGF2BP2-AS1在喉癌各细胞系中的表达

qPCR 检测显示（图1），与16HBE 细胞相比，喉癌细胞AMC-NH-8、TU159、TU138、TU686 中IGF2BP2-AS1 呈高表达（F=37.42，P＜0.01），其中以TU686细胞中IGF2BP2-AS1表达最高（P＜0.01）。因此，后续以TU686细胞为研究。

图1 IGF2BP2-AS1在支气管上皮细胞系16HBE和喉癌细胞系AMC-NH-8、TU159、TU138、TU686中的表达量

2.IGF2BP2-AS1小干扰RNA的敲降效率

qPCR检测显示，si-NC组和si-IGF2BP2-AS1组TU686细胞中IGF2BP2-AS1 表达分别为（7.25±0.22）和（1.02±0.30），si-IGF2BP2-AS1 组TU686 细胞中IGF2BP2-AS1 表达低于si-NC组（t=16.79，P＜0.01），提示IGF2BP2-AS1 小干扰RNA敲降成功。

3.敲降IGF2BP2-AS1后TU686细胞迁移情况

划痕愈合实验显示，si-NC 组和si-IGF2BP2-AS1 组TU686 细胞划痕愈合率分别为（65.08±3.82）% 和（28.16±6.13）%，si-IGF2BP2-AS1 组细胞划痕愈合率低于si-NC组（t=5.11，P＜0.01）。

4.敲降IGF2BP2-AS1后TU686细胞增殖情况

CCK-8 结果显示（图2），在铺板后第2、3、4、5 天si-IGF2BP2-AS1 组TU686 细胞增殖能力均低于si-NC 组（t=3.83、3.17、3.02、6.31，均P＜0.01）。

图2 敲降IGF2BP2-AS1对喉癌细胞TU686增殖的影响

5.IGF2BP2-AS1与miR-375的靶向关系

采用LncRNome在线软件预测显示（图3），IGF2BP2-AS1与miR-375存在结合位点，miR-375可能是IGF2BP2-AS1靶基因。双荧光素酶报告基因检测显示（图4），IGF2BP2-AS1-Wt中，miR-375 组相对荧光素酶活性低于miR-NC 组（t=8.95，P＜0.01）；IGF2BP2-AS1-Mut中，miR-NC组与miR-375组荧光素酶活性比较差异无统计学意义（t=0.74，P＞0.05）。

图3 IGF2BP2-AS1与miR-375的靶向结合位点

图4 双荧光素酶报告基因实验验证IGF2BP2-AS1 与miR-375的靶向关系

6.敲降IGF2BP2-AS1对miR-375表达的影响

si-NC 组和 si-IGF2BP2-AS1 组 TU686 细胞中miR-375 表达分别为（1.02±0.40）和（4.95±0.49），si-IGF2BP2-AS1 组TU686 细胞中miR-375 表达高于si-NC组（t=6.23，P＜0.01）。

7.敲降IGF2BP2-AS1后TU686细胞中迁移及增殖蛋白表达情况

Western blotting 显示（图5），敲降IGF2BP2-AS1 表达后的TU686 细胞中迁移蛋白N-Cadherin、FOXC2 表达与增殖蛋白CDK2、Cyclin A表达均低于si-NC组。

图5 敲降IGF2BP2-AS1 对喉癌细胞TU686 中迁移蛋白和增殖蛋白表达的影响

讨论

研究显示，lncRNA 广泛参与调控细胞的各种生命过程，如凋亡、代谢、迁移［13-16］。喉癌细胞中存在多种lncRNA的异常表达，lncRNA 已成为喉癌诊断的生物标志物以及治疗的分子靶点［17-19］。Lu 等［20］研究显示，喉癌组织和细胞系中lncRNA ZFAS1表达高于癌旁组织和正常鼻咽上皮细胞，高表达的lncRNA ZFAS1 与患者淋巴结转移、临床分期相关，lncRNA ZFAS1 可促进喉癌细胞增殖、侵袭以及N-钙粘蛋白和波形蛋白表达，并抑制E-钙粘蛋白表达。Wan 等［21］研究显示，lncRNA SNHG16 在喉癌组织和细胞系中表达上调，其通过调节miR-140-5p/Wnt/β-catenin 通路轴促进喉癌的发生发展。IGF2BP2-AS1是近年来新发现的一种促癌性lncRNA［11］。Tong 等［12］研究表明，与正常组织样本相比，口腔鳞状细胞癌中IGF2BP2-AS1 表达上调，且IGF2BP 2-AS1 高表达与口腔鳞状细胞癌患者的较差生存率相关；IGF2BP2-AS1 主要定位在细胞质中，其下调能够抑制细胞增殖和迁移，导致细胞周期停滞和细胞凋亡。目前，IGF2BP2-AS1对喉癌细胞调控的功能尚不清楚。

本研究证实，IGF2BP2-AS1在喉癌细胞系中高表达，提示IGF2BP2-AS1 可能参与调控喉癌的发生和进展。沉默IGF2BP2-AS1 表达后，喉癌TU686 细胞增殖和迁移能力均受到限制，说明IGF2BP2-AS1可能是喉癌治疗的潜在靶点。lncRNA 可发挥竞争性RNA 作用，以海绵吸附的方式降低miRNA 的表达，从而影响肿瘤细胞的各种生物过程［22-25］。例如，lncRNA NEAT1 可以通过功能性海绵miR-577 和miR-1224-5p 促进喉癌细胞的增殖，并抑制细胞凋亡［26］。本研究采用生物信息学软件LncRNome 分析显示，IGF2BP2-AS1 的核苷酸序列与miR-375 具有互补位点。miR-375 在结直肠癌、胃癌、膀胱癌等恶性肿瘤中低表达，能抑制肿瘤细胞的细胞周期、转移以及生长［27-29］。Dai等［30］研究显示，miR-375 在喉癌组织和细胞系中表达下调，过表达miR-375 明显抑制喉癌细胞的增殖、细胞周期和迁移能力。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实IGF2BP2-AS1 靶向结合miR-375。在TU686 细胞中，敲降IGF2BP2-AS1 后，miR-375 表达增高，进一步证实miR-375和IGF2BP2-AS1存在负向调控关系。

综上所述，IGF2BP2-AS1 在喉癌细胞系中呈高表达，IGF2BP2-AS1通过海绵吸附miR-375可影响喉癌细胞的迁移及增殖，IGF2BP2-AS1 的研究可为喉癌诊断和靶向治疗提供新的靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明王挺：研究设计与实施、文章撰写；张杨、郭洁：数据采集；范崇盛：研究设计、对文章的知识性内容作批评性审阅；刘亚芳：统计分析、指导