单细胞RNA测序应用于继发性肾病的研究进展

邹皓珍 杨佳 席哲帆 纪瑞 董华

滨州医学院附属医院肾内科，滨州 256603

科学技术的迅猛发展使生物医学研究发生了翻天覆地的改变，由以前研究的器官、组织水平转向了解单个细胞的不同组成结构发展。肾脏是一个复杂且重要的器官，在生理稳态中发挥排泄代谢产物、维持内环境稳态及内分泌等多种重要功能。肾组织含有多种固有细胞及间质细胞，各种细胞大多具有自己独特的转录特征及专属功能［1］。因此，肾脏疾病患者经常出现严重的并发症如高血压、心脑血管疾病等，该病累及的范围广泛，包括肾小球疾病、肾肿瘤等。既往只能检测多种细胞的平均变化水平，无法辨别个别细胞在疾病发生、发展过程中的具体作用。而单细胞测序技术可以从单个细胞水平精确地辨别细胞类型，了解其在疾病中的作用机制，有助于肾脏疾病的治疗及预防。近年来，单细胞测序技术在糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）、狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）中的研究有新进展［1］。本文阐述单细胞测序技术在常见继发性肾病的最新应用研究。

单细胞测序技术

单细胞测序可以获得特定微环境下的细胞测序差异来研究其功能差异。通过分析基因组、转录组、表观组以及空间组等信息来定义细胞类型，深入研究细胞功能、细胞谱系、细胞迁移和转变等，主要包括单细胞基因组测序、转录组测序和表观遗传测序，这3 种测序类型各具特点和优势，可以从各个角度揭示细胞各个阶段的功能和特点。全基因组测序是对目的细胞全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后利用外显子捕获技术进而使用高通量测序的过程［2］。转录组测序是一种用于检测和定量分析信使RNA 分子的方法，其过程包括将RNA 逆转录为cDNA，再行高通量DNA 测序［3］。近年来，转录组测序通常在包含数千到数百万个细胞的样本上进行，主要用途是评估细胞群内的转录相似性和差异，揭示未被认识的异质性水平，追踪异质但相关的细胞状态之间的谱系和发育关系［4］。表观遗传学测序主要在基因调控方面起作用，表观遗传改变是可逆的，也可以决定基因表达并负责细胞的异质性［5-7］。单细胞测序流程包括单细胞的分离制备、遗传物质的提取扩增及高通量测序。

在继发性肾病中的应用

1.DN

DN 是持续高血糖引起的糖尿病微血管并发症，以进展性的肾间质纤维化为特征，是引起终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的首要原因。人们利用单细胞测序技术首先从细胞层面剖析DN 的发病机制，早期研究DN 小鼠和患者肾脏之间的差异性基因表达发现特定基因、靶点及相关信号通路，促进DN 的进展；现在的研究热点是尿液细胞表达谱、药物作用靶点的相关机制［8］。

DN 发病机制与高血压、高血糖、氧化应激、遗传背景、足细胞损伤密不可分，通过单细胞测序技术可检测与DN进展相关的基因。Wang 等［8］利用单细胞RNA 测序（single-cell RNA-sequencing，scRNA-seq）数据中鉴定出13 种细胞类型，在scRNA-seq 数据和Bulk RNA-seq 中鉴定出106 种常见差异表达基因。尿液外泌体微小RNA-451-5p［9］、3 个免疫相关基因（SLIT3、PDE1A、CFH）［10］、MRTF-SRF（在系膜细胞中激活的机械敏感信号通路）［11］可作为DN 的诊断标志物和治疗靶点，而EIF4B、RICTOR、PRKCB［12］、ATF3、B2M、VCAM1、CLDN4、SPP1等［13］均可能促进DN 进展，对早期DN 小鼠巨噬细胞转录组谱分析发现疾病进展中的动态巨噬细胞M1 样炎症表型增加［14］。Fu 等［15］也强调DN 中基因表达的动态变化，以及单个细胞的可变反应。Roumeliotis 等［16］发现SPP1、TPO、TTN、SGO2 等21 个氧化应激基因参与或延缓DN 的发展。有关遗传易感性，GREM1 变异体rs1129456［17］、NCALD 基因［18］与DN 相关；Pei 等［19］对267 例DN 患者EB-1 基因进行单核苷酸多态性基因分型，发现DN 患者和非DN 患者之间有遗传差异；Gu等［20］发现在1型糖尿病（DM）中性别决定区Y-box 2 对DN 具有性别特异性遗传影响。足细胞损伤在DN 中起重要作用，Zhang 等［21］研究显示，吲哚胺2，3-双加氧酶促进DN中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的合成，并减轻高糖诱导的足细胞损伤。Wang 等［22］应用db/db 小鼠，将1 型DM与2 型DM 的足细胞翻译mRNA 图谱进行比较，发现具有差异性及相似性。翁维维等［23］的实验提示自噬活性水平与足细胞功能有关，抑制自噬活性可使足细胞受损。

单细胞测序在尿液细胞研究中也有进展。Abedini等［24］对5 例DN 患者及10 例健康对照组的尿液样本进行分析，将尿液细胞与人类肾脏和人类膀胱数据集进行比较发现，除了巨噬细胞、淋巴细胞和膀胱细胞外，几乎所有的肾细胞类型如足细胞、近端小管、髓袢和集合管都可以在尿液中识别。尿液细胞与人肾细胞在基因表达上具有相似性，以后可采集患者尿液细胞而非肾活检，这种简单的取材方式有助于疾病的诊断，并有助于患者个性化预后［25］。

单细胞测序在治疗DN 的药物作用机制方面是一大热点，血管紧张素受体阻滞剂和钠-葡萄糖协同转运蛋白2 抑制剂（sodium-dependent glucose transporters 2 inhibitor，SGLT2i）被用于治疗DN，但具体作用仍不清楚［26-28］。Wu等［26］鉴定db/db 小鼠10 个不同的肾细胞簇，发现血管紧张素受体阻滞剂具有较强抗炎和抗纤维化作用，而SGLT2i 影响小管线粒体功能，血管紧张素受体阻滞剂和SGLT2i 在保护肾脏中发挥叠加效应而非协同效应。SGLT2i可诱导模拟禁食和缺氧反应，对近端小管富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子7的剪接体选择性剪接调节是潜在作用机制［27］。Dalbøge等［28］在db/db-UNx-ReninAAV 小鼠中发现，司美格鲁肽联合赖诺普利可显著降低血糖、血压和蛋白尿，改善肾小球硬化程度、足细胞过滤缝隙密度，减少炎症。Wang 等［29］发现二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidyl-peptidase 4，DPP4）在DN 足细胞中表达特异性上调，与足细胞增殖有关，半边莲通过抑制足细胞DPP4 的活性来治疗DN。以上为DN 治疗提供了理论依据，期待更多有关药物作用机制的研究。

2.LN

LN 是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）的肾脏损害，是ESRD 的重要原因之一。LN 的复杂性及异质性涉及多种细胞类型以及免疫和非免疫机制，对LN患者的固有肾细胞和浸润细胞进行单细胞测序是一种新方法，可在细胞水平上明确肾损伤途径［30］。LN 是首个应用于单细胞测序肾活检的疾病类型，除了肾组织，血液、尿液、皮肤也可用于LN 单细胞水平检测发现潜在的生物标志物，对LN的发病机制及治疗的研究也层出不穷［30］。

最近对SLE 血液和组织测序显示分子异质性，并确定几个不同的亚群是SLE 发病机制的关键参与者［31］。Nehar-Belaid 等［32］分析外周血单核细胞发现，SLE 患者的干扰素刺激基因（interferon stimulating gene，ISG）表达增加，富含ISG 和/或单基因狼疮相关基因的独特亚群的扩增与疾病活动性相关。Vanarsa 等［33］对SLE 患者尿液进行筛选，发现尿血管生成素样蛋白4（Angptl4）、L-选择素和转化生长因子（TGF）-β1 为LN 疾病活动的潜在生物标志物。同样，Arazi等［34］发现2种趋化因子受体CXCR4和CX3CR1广泛表达，免疫细胞在尿液和肾脏中的基因表达密切相关。干扰素（interferon，IFN）-γ 诱导的趋化因子较高为增生性LN，首次应用尿液蛋白质组学结合肾活检单细胞转录组发现尿液趋化因子主要由浸润CD8+T 细胞、自然杀伤（NK）细胞和骨髓细胞产生，而尿液趋化因子数目与肾浸润性CD8+细胞数相关［35］。早期增生性LN 患者肾小球样本间基因表达有很大的异质性，可鉴定IFN 诱导基因特征等4 个主要簇［36］。Der 等［37］对21 个肾脏和17 个皮肤样本进行研究发现，小管细胞和角质细胞IFN 评分之间以及小管细胞和角质细胞纤维化评分之间的相关性，并证明慢性指数、免疫球蛋白G（IgG）沉积和蛋白尿量与肾小管细胞中由IFN 诱导基因组成的基于转录组的评分相关［38］。以上研究表明血液、尿液、皮肤的scRNA-seq 分析可作为肾脏疾病的生物标志物，说明了scRNA-seq 的潜在用途，为LN 的发病机制提供新见解。

近来研究发现，TNFSF13B［39］、白细胞介素（IL）16［40］、可溶性CD163［41］、循环免疫复合物［42］与LN 的发病机制有关，转化生长因子β 信号传导参与LN 的发展［43］，microRNA-199a通过靶向Klotho调节核因子（NF）-κB的激活而参与LN发病机制［44］。通过蛋白质组学方法发现杀菌/通透性增加蛋白在T 细胞衍生的外泌体或外周血T 细胞中的过表达可能是LN 的生物标志物和致病因素［45］。IFN 信号有IFN-α、IFN-β和IFN-γ 3种反应基因，含有细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA4）rs17268364 的狼疮易感区通过结合EWSR1 在功能上降低CTLA4 的表达，并与IFN-α 信号相关［46］。

Zhou 等［47］研究显示，间充质干细胞通过减少CD4+、CD8+、巨噬细胞、长寿命浆细胞、促炎中性粒细胞和树突状细胞对肾脏区域免疫细胞的影响来治疗LN。Peng 等［48］发现一种新的DDX58致病性变体R109C可提高IFN信号传导而致病，Janus蛋白酪氨酸激酶（JAK）抑制剂可用于LN 的治疗。厚朴酚可抑制NLRP3/IL-33/ST2 轴的激活来抑制肾脏固有巨噬细胞和肾小管上皮细胞之间的异常串扰，从而对LN起到预防和治疗作用［49］。

结语与展望

近几年随着单细胞测序技术的深入研究，scRNA-seq技术与常规组学或单细胞组学的联合分析会成为大热点，如结合scRNA-seq 与批量RNA 测序可以发现组织转录数据特异性信息，识别细胞与组织水平的共同特征；肾scRNA-seq 与尿蛋白组学联合分析有助于挖掘疾病活动的生物特异性标志物，寻找反映肾脏复杂分子生物学活动的尿蛋白［50］。最后，还有利于生物标志物和新药的研发，scRNA-seq 可能会取代大量基因表达实验，包括肾脏疾病。虽然在肾脏疾病领域应用较少［51］，但是随着单细胞测序相关方法变得更加精练、更高通量、更廉价，以及在灵敏度、准确性、成本效益、处理时间和每个细胞可评估的参数方面的改进，相信未来几年该项技术在肾脏领域的基础和临床方面的研究将更加广泛，也可能会改变对肾脏疾病分子发病机制的理解［52］。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明邹皓珍、纪瑞：起草文章，指导；杨佳：对文章的知识性内容作批评性审阅，指导，支持性贡献；席哲帆：分析/解释数据，起草文章，指导；董华：对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献