加味芍药甘草汤基于Toll样受体4/核因子κB信号通路对多囊卵巢综合征大鼠妊娠结局及免疫机制的影响※

梁爽爽 朱 莎 刘妮英 肖新益

(湖北省中西医结合医院妇产科,湖北 武汉 430015)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)常见于育龄妇女,是一种内分泌和代谢异常疾病,以无排卵、卵巢多囊样、高雄激素血症等为临床主要症状[1]。近年PCOS的发病率逐年增加,其可导致患者无排卵性不孕,对女性的身心健康造成严重影响[2]。目前,PCOS的发病机制尚未明确,有学者研究发现[3-4],慢性低度炎症可介导PCOS的发生发展,研究发现肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)水平在PCOS女性体内明显升高。因此,可从炎症角度对PCOS进行认知,可为PCOS治疗的靶点。目前临床上常采用克罗米芬、来曲唑等药物治疗PCOS,但不能完全改善临床症状,不能满足PCOS患者的生殖需求,且不良反应和并发症均较多[5]。而中医因其具有整体性、多靶点且副作用小的优势,受到越来越多的关注。芍药甘草汤主要由芍药和甘草两味中药组成,两者合用理气健脾,滋阴养肝,缓急止痛,活血化瘀[6]。有研究发现[7-8],芍药甘草汤及有效成分能有效降低PCOS患者血清中游离睾酮水平,进而提高患者的妊娠率。中医学认为,肾虚血瘀导致PCOS的发生。加味芍药甘草汤是在芍药甘草汤的基础上加入泽兰活血化瘀,疏通血脉,行水消肿,治疗闭经、痛经及月经紊乱等[9]。目前有研究发现[10],多种中药可通过抑制Toll样受体4/核因子κB(TLR4/NF-κB)信号通路达到缓解或治疗慢性低度炎症目的,从而改善PCOS临床症状。因此本研究建立PCOS大鼠模型,研究加味芍药甘草汤通过调控TLR4/NF-κB信号通路对PCOS大鼠妊娠结局及免疫机制的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 80只6周龄雌性SD大鼠,SPF级,均购自青海大学医学院动物实验中心,动物合格证号:SCXK(青)2018-0013。体质量180～200 g,统一饲养在22 ℃、相对湿度为50%的动物房内,光暗12 h交替更换,适应性喂养1周,自由饮水、饮食。

1.2 药物 加味芍药甘草汤药物组成为白芍、甘草、泽兰,购自山西医科大学第二医院中药房,且由该医院鉴定为正品。取白芍、甘草、泽兰各600 g,粉碎后混合,将10倍量的水加入到药物中,浸泡1 h后煎煮2次,每次1 h;过滤煎煮后浓缩成含生药4.24 g/mL的药液,即加味芍药甘草汤。本实验药量根据临床实验中人体剂量的折算标准,按低、中、高药物比例分别为0.5∶1∶2,即得到低、中、高剂量为12.5、25.0、50.0 g/(kg·d)。炔雌醇环丙孕酮片(深圳市康哲药业有限公司,国药准字J20140114),来曲唑片(浙江海正药业股份有限公司,国药准字H20133109)。

1.3 试剂和仪器 TLR4抑制剂TAK-242(北京百奥莱博技术有限公司);TLR4、NF-κB抗体(上海连硕生物科技有限公司);吉姆萨染液(上海泽叶生物科技有限公司);高速离心机(D37520 Osterode型,德国Biofuge公司);CytoFLEX型流式细胞仪[贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司];TLR4、p-NF-κB p65、β-actin抗体(英国Abcam公司);蛋白提取试剂盒购(北京普非生物科技有限公司);超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司);DM3000生物光学显微镜(德国Leica公司);PROTEAN小型蛋白电泳转膜系统(美国Bio-Rad公司)。

1.4 分组、模型制备和给药 将80只大鼠随机分为空白组10只和造模组70只。造模组采用来曲唑片诱导制备PCOS大鼠模型,将来曲唑片溶于1%羧甲基纤维素钠中,予来曲唑溶液1 mg/(kg·d)灌胃21天;空白组大鼠予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。造模后每日对造模组大鼠进行阴道涂片,并经吉姆萨染液染色,观察大鼠动情周期变化。大鼠进行阴道涂片处理,将棉签浸泡在0.9%氯化钠溶液中,然后用棉签在大鼠阴道侧壁上的1/3处轻轻刮取,将得到的黏液和细胞轻薄且均匀涂抹在载玻片上,将其置于无水乙醇中固定,3 min后将吉姆萨染液染色加入到载玻片中并染色,置于光学显微镜下观察细胞变化情况。空白组大鼠有4～5天的规律动情周期,可分为4个阶段,即以有核上皮细胞为主的动情前期,以无核不规则状角化上皮细胞为主的动情期,同时可见有核上皮细胞、角化上皮细胞与白细胞的动情后期,以白细胞为主的动情间期。而造模大鼠动情周期明显紊乱,表示PCOS模型制备成功。将造模成功的70只大鼠按照随机数字表法分为7组,模型组10只予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,加味芍药甘草汤低、中、高剂量组各10只,分别予加味芍药甘草汤12.5、25.0、50.0 g/kg灌胃,炔雌醇环丙孕酮片组10只予炔雌醇环丙孕酮片0.2035 g/kg灌胃,抑制剂组10只经尾静脉注射TAK-242 10 mg/kg,联合组10只予加味芍药甘草汤50 g/kg灌胃,同时尾静脉注射TAK-242 10 mg/kg,空白组10只大鼠予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。各组大鼠均每日给药1次,连续给药2周。

1.5 大鼠体质量及卵巢质量 测量各组大鼠给药结束后体质量,再在末次给药24 h后分别处死大鼠,取出卵巢,快速去除两侧卵巢多余组织,称取卵巢组织质量。

1.6 T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+各组大鼠末次给药24 h后,麻醉各组大鼠,取腹主动脉血5 mL,将血液用EDTA抗凝后,各组取60 μL血加入到流式细胞仪中,检测T细胞亚群中CD4+、CD8+细胞百分率和CD4+/CD8+。

1.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测卵巢组织中TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)表达 末次给药24 h后,取各组大鼠部分卵巢组织50 mg,于冰上裂解组织至组织均浆,离心组织均浆,用DAB法检测上清液中蛋白浓度。分别配置浓缩和分离胶,浓度分别为5%和8%,在胶孔中分别加入样品蛋白,电泳10 min后转膜。孵育2 h后,将5%封闭液加入到样品中,激活后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,封闭PVDF膜1 h。分别加入一抗TLR4、NF-κB过夜,继续加入HRP标记的二抗,继续孵育2 h,采用磷酸缓冲生理盐水洗涤,取ECL发光液A和B等量混匀,加在膜的正面与之充分接触,成像后通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。用ECL检测细胞PVDF膜并成像。

1.8 检测各组大鼠妊娠率和各组孕鼠的胚泡着床数 末次给药后12 h,均随机取各组8只雌性大鼠,于下午6∶00与雄鼠按照2∶1合笼,次日早8∶00检查阴道涂片,以发现大量精子者记为妊娠第1天,如未见大量精子记为未孕鼠。于妊娠第8天下午4∶00处死,摘取双侧子宫,记录所有孕鼠数及每只孕鼠的胚泡着床数,比较各组妊娠率(妊娠率=孕鼠数/受试动物数×100%)及各组孕鼠胚泡着床数。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量和卵巢质量比较 与空白组比较,模型组体质量和卵巢质量均升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠体质量和卵巢质量均降低(P<0.05);加味芍药甘草汤低、中、高剂量组体质量和卵巢质量组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖;加味芍药甘草汤高剂量组、炔雌醇环丙孕酮片组和抑制剂组大鼠给药后体质量和卵巢质量两两比较差异无统计学意义(P>0.05);与加味芍药甘草汤高剂量组比较,联合组大鼠给药后体质量和卵巢质量均降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠体质量和卵巢质量比较

2.2 各组大鼠T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较 与空白组比较,模型组大鼠CD4+、CD4+/CD8+降低(P<0.05),CD8+升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠CD4+、CD4+/CD8+均升高(P<0.05),CD8+均降低(P<0.05);加味芍药甘草汤低、中、高剂量组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);加味芍药甘草汤高剂量组、炔雌醇环丙孕酮片组、抑制剂组大鼠CD4+、CD8+、CD4+/CD8+两两比较差异均无统计学意义(P>0.05);与芍药甘草汤高剂量组比较,联合组大鼠CD4+、CD4+/CD8+均升高(P<0.05),CD8+降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较

2.3 各组大鼠卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达比较 与空白组比较,模型组大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达均升高(P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达均降低(P<0.05);加味芍药甘草汤低、中、高剂量组TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),且呈剂量依赖;加味芍药甘草汤高剂量组、炔雌醇环丙孕酮片组组和抑制剂组大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);与芍药甘草汤高剂量组比较,联合组大鼠TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达均升高(P<0.05)。见表3、图1。

图1 各组大鼠卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达水平

表3 各组大鼠卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达比较

2.4 各组大鼠妊娠率和各组孕鼠的胚泡着床数比较 与空白组比较,模型组大鼠妊娠率和胚泡着床数均降低(P<0.05);与模型组比较,加味芍药甘草汤中、高剂量组大鼠妊娠率升高,加味芍药甘草汤低、中、高剂量组大鼠胚泡着床数升高(P<0.05),且呈剂量依赖;加味芍药甘草汤高剂量组、炔雌醇环丙孕酮片组和抑制剂组大鼠妊娠率和胚泡着床数比较差异均无统计学意义(P>0.05);与加味芍药甘草汤高剂量组比较,联合组大鼠胚泡着床数升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠妊娠率和各组孕鼠的胚泡着床数比较

3 讨论

PCOS发病机制复杂,目前临床上治疗PCOS方法主要为对症治疗,但治疗效果并不十分理想[11]。PCOS在中医学中被归为“闭经” “不孕”“崩漏”“癥瘕”等范畴,认为气虚痰瘀是导致PCOS发病的关键因素。加味芍药甘草汤中白芍养血敛阴,理气健脾;甘草益血通经,缓急止痛;泽兰活血祛瘀,利水消肿[12]。有研究表明[13],芍药苷对离体脂肪组织分解有明显的促进作用,白芍对卵巢肥胖大鼠的体质量有抑制作用。本实验结果显示,加味芍药甘草汤可减轻PCOS大鼠体质量和卵巢质量,且呈剂量依赖。有文献显示[14],PCOS患者轻微减重,可促进自发排卵,增加妊娠率,且对高雄激素症、高脂血症有明显的改善作用。由此可见,加味芍药甘草汤可通过减轻体质量而改善PCOS症状。子宫内膜是女性生殖功能的基本结构单位,也是能量代谢活跃的器官。当子宫内膜容受性受损时,胚泡着床会发生障碍,从而导致PCOS患者不易受孕或受孕后容易流产。本研究结果显示,加味芍药甘草汤可增加PCOS大鼠妊娠率和胚泡着床数,提示加味芍药甘草汤可促进PCOS大鼠胚泡着床数,进而改善PCOS大鼠预后。有研究证实,可通过上调子宫内膜PR表达改善卵巢功能,提高子宫内膜容受性和早期妊娠率,从而改善妊娠结局[15]。

有文献显示,机体在排卵前卵泡存在多种免疫细胞,包括T淋巴细胞等,当免疫细胞异常表达时,机体免疫功能紊乱,从而导致机体所分泌的免疫相关因子比例严重失调,引发PCOS[16]。近年来免疫学快速发展,学者们也逐渐认识到PCOS的发病机制可能与T淋巴细胞亚群密切相关[17]。在所有成熟的T淋巴细胞表面均有CD3+分子的表达,而CD4+、CD8+会在不同的成熟T淋巴细胞表面表达。CD4+细胞可分泌白细胞介素2(IL-2)、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)等介质,进而对B细胞产生的抗体进行促进;而CD8+可对B细胞产生抗体进行抑制。胡伟娇等[18]通过研究发现,与正常女性比较,PCOS患者卵泡液中CD3+细胞、CD8+细胞比例显著降低,表明PCOS患者体内免疫系统处于紊乱状态。除此之外,外周活化的T淋巴细胞可诱导其受体PD-1的表达,并通过抑制PCOS患者CD4+和CD8+细胞功能而降低IFN-γ表达,进而对T淋巴细胞亚群的功能起到抑制作用;另外,当T淋巴细胞亚群功能出现失调时,雌激素水平降低,IFN-γ和PD-1异常表达,进而对卵泡发育、排卵造成影响。本研究结果显示,PCOS大鼠CD4+、CD4+/CD8+均降低,CD8+升高,提示PCOS大鼠体内免疫系统处于紊乱状态,加味芍药甘草汤干预后PCOS大鼠CD4+、CD4+/CD8+升高,CD8+降低,提示加味芍药甘草汤可改善PCOS大鼠免疫功能。

目前,PCOS的发病机制尚不完全清楚,但近年来发现慢性低度炎症可介导PCOS的发生发展。研究发现,PCOS以双侧卵巢增大、白膜增厚并发生硬化、皮质出现纤维化、卵巢间质增生等为主要病理改变,同时也是慢性增生性炎症的一种表现[19]。有研究显示,激活的TLR-4 /NF-κB炎症信号通路与多种炎症疾病的发生发展密切相关。TLR4是炎性反应的“闸门”,适度的TLR4表达可维持机体功能,但TLR4过度表达可损伤相关组织[20]。TLR4可通过MyD88而活化NF-κB。NF-κB是炎症启动和调节过程中关键的转录因子之一,可介导炎症的发生发展。在静息状态下,NF -κB家族蛋白可结合其遏制物核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α),从而形成无活性三聚体,当细胞内内外源性刺激无活性三聚体后,IκB-α会通过磷酸化和泛素化降解而释放大量的NF-κB易位,从而磷酸化细胞核,后可结合转录调控元,从而激活下游多个炎症基因的转录,导致炎症发生。本研究结果显示,PCOS大鼠卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达升高,加味芍药甘草汤干预组大鼠卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达降低。由此可见,PCOS大鼠存在慢性增生性炎症状态,加味芍药甘草汤可通过抑制TLR4和p-NF-κB p65的表达抑制炎症状态。常壮鹏等[21]研究证实,加味芍药甘草汤可能通过抑制NF-κB炎症信号通路的活化减少炎症因子释放,达到调节卵巢激素微环境并且改善多囊卵巢形态和功能的作用。为证实加味芍药甘草汤能通过抑制TLR4/NF-κB通路而对PCOS进行调控,本研究采用TLR4/NF-κB信号通路抑制剂TAK-242对PCOS大鼠进行干预,结果显示,TAK-242能降低大鼠体质量和卵巢质量,改善大鼠体内免疫功能,抑制卵巢组织中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表达,增加妊娠率和胚泡着床率。为进一步证实加味芍药甘草汤是通过抑制TLR4/NF-κB通路而对PCOS大鼠发挥作用,本研究用加味芍药甘草汤高剂量联合TAK-242干预PCOS大鼠,结果发现其干预效果高于单独使用加味芍药甘草汤或TAK-242。

综上所述,加味芍药甘草汤能通过抑制TLR4/NF-κB通路调节PCOS大鼠免疫机制,改善PCOS大鼠妊娠结局。