应用网络药理学及分子对接技术研究甘草泻心汤治疗白塞病的分子机制※

郜晨静 罗亚萍△ 张 宁 郝梦桃

(1.河北中医药大学第一附属医院风湿病科,河北 石家庄 050011;2.北京中医药大学2021级博士研究生,北京 100105;3.河北中医药大学研究生院2020级硕士研究生,河北 石家庄 050091)

白塞病(Behcet's disease,BD)又称贝赫切特综合征,临床缺乏特异性实验室检查,主要以反复口腔和生殖器溃疡、眼部无菌性葡萄膜炎、皮肤病变等临床表现及皮肤针刺试验阳性为依据进行诊断。BD是一种慢性、反复发作性疾病,随着疾病的进展,可损害全身多个器官及系统,最常见的有血管系统、神经系统和胃肠。除外眼部、全身大血管及中枢神经系统受累者预后较差,BD患者大多预后良好。目前尚无治愈BD的特效药物及方法,临床主要以减轻症状,减少复发,预防并发症发生,延缓病情进展作为治疗目的。BD的主要临床表现为口腔溃疡及阴部溃疡,与中医学“狐惑病”的临床症状相符[1],正如张仲景《金匮要略·百合狐惑阴阳毒病脉证治》所载:“狐惑之为病……蚀于喉为惑,蚀于阴为狐……甘草泻心汤主之。”甘草泻心汤口服治疗BD已在临床广泛应用[2],名老中医李发枝使用甘草泻心汤治疗复发性口腔溃疡也取得较好疗效[3]。但目前对其机制的研究较少,临床缺乏有力的证据。本研究依据网络药理学多种途径探索的理念,采用网络药理学及分子对接技术研究分析甘草泻心汤治疗BD的作用机制,为甘草泻心汤的临床应用和研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件 中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php),UniProt数据库(https://www.uniprot.org/),GeneCard数据库(https://www.genecards.org/),PharmGkb数据库(https://www.pharmgkb.org/),TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/),OMIM数据库(https://omim.org/),DrugBank数据库(https://go.drugbank.com/),STRING数据库(https://cn.string-db.org/),PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),PDB数据库(http://www1.rcsb.org),Cytoscape 3.8.0 软件,R×64 4.0.5软件,AutoDock Tools 1.5.6软件,ChemOffice软件,AutoDock-vina 1.2软件,PERL软件。

1.2 方法

1.2.1 甘草泻心汤化学成分及作用靶点筛选 将甘草泻心汤所有药物(甘草、干姜、半夏、黄芩、黄连、人参、大枣)名称输入TCMSP,设置生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,类药性(drug-likeness,DL)≥0.18为筛选条件,得出此方剂的化学成分和作用靶点。利用UniProt数据库及“PERL”软件,将化学成分和作用靶点的蛋白基因进行注释、筛选。通过筛选条件“homo sapiens”“reviewed”,得到药物靶点。

1.2.2 BD疾病靶点筛选 以“Behcet's disease”为关键词,分别在GeneCard数据库、PharmGkb数据库、TTD数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库中进行检索,获得BD疾病靶点。

1.2.3 药物-疾病交集靶点获取 利用R×64 4.0.5软件获取药物靶点与疾病靶点的交集靶点,为甘草泻心汤治疗BD的潜在靶点。

1.2.4 药物-成分-疾病靶点网络图 将交集靶点输入 Cytoscape 3.8.0 软件中,得到药物-成分-疾病靶点网络图。其中四周圆圈代表药物的成分,不同颜色代表不同药物,中心方形代表疾病靶点基因,连线代表两者之间联系度,根据度 (Degree) 值进行分类,Degree值越大,两者联系越紧密,据此得出甘草泻心汤作用于BD的核心成分。

1.2.5 蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)网络构建及分析 将交集靶点上传到STRING数据库,选定物种为“人”,设置最高置信度≥0.9,获得PPI信息。使用Cytoscape 3.8.0软件建立PPI网络图,下载对应格式文件,并进行拓扑分析。根据节点连接Degree值、半局域中心性(semi-local centrality)等参数连续筛选3次后得到核心靶点。Degree值、半局域中心性数值越高,相互联系越紧密,关联性越高。

1.2.6 基因本体(GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 使用R×64 4.0.5软件和脚本对交集靶点文件进行id转换后,进行GO功能富集以及KEGG通路富集分析。选取功能富集程度前10位的条目制成柱状图,富集程度前30的通路制成气泡图进行可视化。

1.2.7 分子对接验证 在PDB数据库下载甘草泻心汤的核心成分(配体)的2D结构,使用ChemOffice软件将2D结构转化为3D结构。在PDB数据库下载核心靶点基因(受体)的3D结构,去除其内部小分子配体和水分子结构,储存后录入到AutoDock Tools 1.5.6软件中,上传加氢之后的受体文件,设置其原子种类后,将其转化为“pdbqt”格式。使用AutoDock-vina 1.2软件将受体及配体进行对接,得出对接图。

2 结果

2.1 甘草泻心汤化学成分及作用靶点筛选结果 在 TCMSP数据库中共得到236个化学成分、3480个作用靶点,化学成分中甘草102个,黄芩46个,大枣29个,人参6个,半夏19个,黄连24个,干姜10个。使用UniProt数据库及“PERL”软件将化学成分及作用靶点文件合并脚本后进行规范化标注,筛选保留有效靶点,共得到247个作用靶点。

2.2 BD疾病靶点筛选 通过GeneCard数据库、PharmGkb数据库、TTD数据库、OMIM数据库、DrugBank数据库分别获得BD疾病靶点615个、205个、344个、12个、1个,经整理、去重后共获得986个BD疾病靶点。

2.3 药物-疾病交集靶点获取 应用R×64 4.0.5软件将247个药物作用靶点与986个BD疾病靶点取交集,得到交集靶点63个。

2.4 药物-疾病成分靶点网络图及分析结果 对药物-成分-疾病靶点网络图进行分析后发现,共有208个结合位点。汇总其Degree值,数值越大,代表相应的活性成分对BD的治疗作用越强。选取Degree值≥40的有效成分进行分析,筛选出7个核心成分,即槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、豆甾醇(stigmasterol)、黄芩甙元(baicalein)、富马碱(fumarine)、汉黄芩素(wogonin)。见图1。

图1 药物-成分-疾病靶点网络图

2.5 PPI网络构建及核心靶点预测 将交集靶点导入STRING数据库,生成PPI网络。分别用不同节点和颜色表示不同基因和连接。运用Cytoscape 3.8.0软件进行网络拓扑结构筛选,重复筛选3次后得到7个核心靶点,分别是前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、白细胞介素18(IL-18)、CC趋化因子配体2(CCL2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、CXC 趋化因子配体 8(CXCL8)。见图2、3。

图2 PPI网络图

图3 PPI网络拓扑分析核心靶点图

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共得到1804个条目,其中生物过程(biological process,BP)1675个,涉及对脂多糖、生物刺激的反应、对细胞凋亡的调节、对氧化代谢、氧化应激的过程等;细胞组成(cellular component,CC)23个,涉及细胞器外膜、胞质囊腔、质膜筏等;分子功能(molecular function,MF)106个,涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、酶结合等方面。KEGG通路富集共得到106条通路,涉及晚期糖基化终末产物/晚期糖基化终末产物受体(AGE-RAGE)信号通路、IL-17信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路、辅助性T淋巴细胞(Th17)细胞分化通路、核因子κB(NF-κB)信号通路、Toll样受体信号通路以及松弛素信号通路等。见图4、5。

图4 GO功能富集分析图(排名前10)

图5 KEGG通路富集分析图(排名前30)

2.7 分子对接验证结果 将筛选得到的7个核心有效成分及7个核心靶基因通过Auto Dock-vina 1.2软件进行分子对接。根据其结合能数值判断其结合能力,结合能数值越高表示结合能越差。结果显示,各结合位点结合能均<-6.8 kcal/mol,证明药物核心成分(配体)与核心靶基因(受体)之间结合能力较强,分子对接良好,两者之间有较高的关联性。其中槲皮素与STAT3、槲皮素与CXCL8的对接结合最强。见图6。

图6 分子对接图(部分)

3 讨论

目前BD病因和发病机制尚未完全阐明,可能与遗传、免疫、感染等因素相关。早期有研究发现,HLA-B51基因与BD密切相关[4],此后STAT3、IL-18等相关基因及分子与BD发病的研究越来越多。临床常用糖皮质激素、免疫抑制剂(如秋水仙碱、沙利度胺、环孢素、环磷酰胺等)及生物制剂(如肿瘤坏死因子拮抗剂等)等治疗BD,存在副作用较多的问题。张志瑞等[5]研究显示,中西医结合治疗BD临床症状改善率、疾病复发率及总有效率等均优于西医组。中医学认为,BD与古代“狐惑”相似,发病与“虫”“毒”有关。《医宗金鉴》认为狐惑谓:“孤惑、牙疳、下疳等疮之古名也,……下疳即狐也,蚀烂肛阴;牙疳即惑也,蚀咽腐龈,脱牙穿腮破唇,因伤寒病后,余毒与湿之为害也。”孙思邈《备急千金要方》提出本病“湿毒气所为”。《类证活人书》提出“狐惑与湿匿皆虫证”,认为其治疗应驱虫为主。综合各医家观点并结合现代临床分析认为,BD为湿热内蕴,上蒸下注,或循经上沿,或下注二阴所致,若疾病日久,或失治误治,则可出现阴虚内热、脾肾阳虚、痰湿内蕴之证。甘草泻心汤治疗狐惑病流传至今,且多项临床试验证实其治疗BD确实有较好的效果[6]。

本研究通过PPI网络分析,得到甘草泻心汤治疗BD的核心靶点为PTGS2、IL-18、STAT3、VEGFA等。PTGS2表达上调可催化花生四烯酸,生成各种类型的前列腺素,促进炎症反应及疼痛的产生。XU Y等[7]提出,抗原提呈细胞对活化的Th1细胞进行诱导,生成过多的干扰素γ(IFN-γ),诱导IL-18的产生,IL-18通过基因多态性促使BD的发生。鲍华芳等[8]认为STAT3通路激活能够介导Th1、Th17因子活化,活化的Th1、Th17因子与BD活动性存在较强相关性。

GO富集分析结果显示,甘草泻心汤治疗BD主要涉及对脂多糖、对生物刺激的反应、对氧化代谢、氧化应激的过程、细胞凋亡过程调节等BP。在革兰阴性菌外膜中,脂多糖作为其重要的成分之一,可引发炎症免疫反应[9]。氧化应激也是BD发病的重要机制。在自身免疫性疾病中,免疫应答与内源性或外源性抗原相互作用导致活性氧产生,氧化应激可能与炎症呈正相关[10]。BD的发病还与内皮损伤和功能紊乱有关,尤其是血管型BD。BD的发病可能与中性粒细胞受到刺激后与血管内皮的黏附性增强,活性氧生成增加,导致血管内皮损伤,从而诱发血管炎,最后出现BD病理改变有关[11]。邬锐等[12]证实,BD患者动脉硬化指数和颈动脉内膜中层厚度均高于正常人。此外,BD的发病与病毒和细菌感染存在相关性[13]。肿瘤的发生与细胞凋亡密不可分,BD发病可能与肿瘤的发生存在某种关联,且两者容易合并发生,以血液系统恶性肿瘤居多,但二者的关联性尚待进一步研究。

KEGG通路富集分析结果显示,甘草泻心汤治疗BD的通路主要包括AGE - RAGE信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、Th17通路等。研究发现,BD患者血清中IL-17、Th17水平升高,可能通过这两种因子介导的通路调控疾病的发生[14]。Th1、Th17与多种风湿性疾病活动相关[15],STAT3为BD的核心基因,Th1、Th17可活化激活STAT3,影响BD的进程,与BD疾病活动性相关。IL-17信号通路在一定程度上影响动脉粥样硬化的进程[16-17],而血管型BD通常有动脉粥样硬化的发生。

本研究结果表明,甘草泻心汤治疗BD的核心成分为槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、黄芩甙元、富马碱、汉黄芩素。黄芩的主要成分有汉黄芩素、黄芩甙元及β-谷甾醇等,可通过AGE-RAGE、IL-17等信号通路调控VEGFA蛋白等发挥作用[18]。汉黄芩素具有抗病毒、抗炎、抗血小板聚集等多种药理作用,其对炎症引发的多种疾病具有治疗效果[19]。谢苗苗等[20]研究证实汉黄芩素有抗炎、抗肿瘤等药理作用。胡青等[21]通过小鼠实验证实黄芩甙元通过调控NF-κB /STAT3/细胞外信号调控激酶(ERK)信号通路,抑制NF-κB p65、STAT3、ERK等蛋白磷酸化,从而减少炎症细胞聚集,减轻炎症反应。槲皮素通过抑制瘦素(LP)调节免疫、抗炎[22],还能通过NF-κB和活化蛋白-1(AP-1)信号通路来抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的细胞凋亡和炎症[23]。LEE J等[24]认为槲皮素可通过抑制TNF-α、IL-6等细胞因子的形成而发挥抗炎作用。褚小磊等[25]研究显示槲皮素能抑制胶原诱导性关节炎大鼠血中TNF-α、IL-17等因子的表达而发挥治疗效果。β-谷甾醇和豆甾醇是常见的植物甾醇,均有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等生物活性[26-27]。山奈酚有抗氧化和抗炎的特性[28],有研究表明山奈酚可抑制小胶质细胞激活,从而减少炎症因子如IL-1β、TNF-α的分泌从而发挥抗炎作用[29]。富马碱可延缓细胞凋亡,能通过减少炎症因子的生成达到抗炎作用[30]。

综上,甘草泻心汤中的有效成分可通过不同的通路和靶点治疗BD。本研究通过网络药理学的研究方法初步预测出甘草泻心汤治疗BD的核心药物成分、核心靶点及主要通路和机制,为甘草泻心汤治疗BD提供了理论依据。本研究尚未进行实验研究,存在一定局限性,有待进一步完善。