凝结芽孢杆菌培养液及其离心上清液、菌悬液的抑菌性能研究

■ 王雪艳 王乙茹 黄遵锡 陈德近 周安树 何 雪 安清聪 程志斌*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2.达州职业技术学院，四川 达州 635001；3.云南师范大学生命科学学院，云南 昆明 650222；4.爱科特生物工程(昆明)有限公司，云南 昆明 650506)

大量体内外试验及综述表明，抑菌性能是饲用凝结芽孢杆菌平衡或调控畜禽肠道菌群、改善生产性能的重要作用机制之一[1-7]。体外菌株的抑菌性能评估可用于高效筛选优质饲用凝结芽孢杆菌产品，常用方法是牛津杯抑菌试验法。然而，当前凝结芽孢杆菌体外牛津杯抑菌试验操作尚无国家标准，造成不同研究报道的抑菌圈直径值及其代表的抑菌作用差异较大，这在本课题组前期综述已有描述。本文推测，除了不同研究中凝结芽孢杆菌菌株的差异外，牛津杯体外抑菌的很多操作步骤对抑菌圈直径有影响，分析如下：①凝结芽孢杆菌培养液及其处理方式。绝大多数牛津杯抑菌试验操作，均在牛津杯中直接注入凝结芽孢杆菌培养液。随着凝结芽孢杆菌分泌抗菌肽类物质的抑菌机制逐步清晰[8-10]，近年来有少量研究将凝结芽孢杆菌培养液进行前处理，并比较凝结芽孢杆菌培养液、培养液离心后的上清液、培养液离心后的底层菌悬液之间抑菌性能的差异，以期获得客观、真实的体外抑菌结果[11-12]。然而令人遗憾的是，目前少量的报道结果有较大差异。②凝结芽孢杆菌培养液的pH。很多综述文章提示，凝结芽孢杆菌分泌乳酸等酸性物质，而乳酸等酸性物质具有抑菌性能，这也可能是凝结芽孢杆菌抑菌作用机制之一[13-14]。然而，这一假设并无更多的体内外试验验证，这不利于支撑饲用凝结芽孢杆菌在畜禽胃肠道不同pH 环境下，调控肠道菌群的作用效果。

鉴于此，本试验参照畜禽胃肠道pH环境，比较研究了凝结芽孢杆菌培养液及其离心上清液、菌悬液在不同pH条件下对3个肠道有害菌的抑菌作用，为规范凝结芽孢杆菌牛津杯抑菌法的操作提供科学依据，为科学、准确地评估凝结芽孢杆菌体外抑菌性能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

凝结芽孢杆菌（菌株编号为YNAU 3127）由课题组前期从云南当地品种“大河猪”肠道中分离[15-17]。牛津杯体外抑菌试验的指示菌猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuisBNCC186354）、鸡白痢沙门氏菌（S.pullorumBNCC124693）、大肠杆菌K88（E.coliCGMCC1.2385）购买于北纳创联生物科技有限公司。

1.2 试验设计

针对可能影响凝结芽孢杆菌牛津杯法体外抑菌作用的两个因素（菌液的处理、菌液的pH），试验设计了主效应因素（菌液的处理）和次效应因素（菌液的pH）进行研究。①主效应设计4 个处理组，对照组（无菌蒸馏水, sterile distilled water，SDW组）、凝结芽孢杆菌培养液组（B.coagulansculture solution，BCS组）、凝结芽孢杆菌培养液离心后的上清液组（centrifuged supernatant ofB.coagulansculture solution, CSS 组）、凝结芽孢杆菌培养液离心后的底层菌悬液组（centrifuged bacterial suspension ofB.coagulansculture solution, CBS 组）；②次效应参照畜禽胃肠道pH，设计pH 2.5、4.0、5.5、7.0条件下，检测4个处理组对3个肠道有害菌指示菌的体外抑制作用。

1.3 牛津杯抑菌试验

1.3.1 BCS组、CSS组、CBS组的制备

1.3.1.1 制备凝结芽孢杆菌菌液采用改良MRS 培养基，有氧培养凝结芽孢杆菌24 h[15-16]，制备凝结芽孢杆菌菌液180 mL。

1.3.1.2 调整凝结芽孢杆菌菌液的pH

将180 mL分为4份（每份45 mL），装于4个50 mL无菌离心管。依据菌液初始pH（实测pH 为4.7±0.1），用乳酸和NaOH 依次将4 个离心管的菌液pH 调为2.5、4.0、5.5、7.0。

1.3.1.3 制备凝结芽孢杆菌的BCS组、CSS组、CBS组

调完pH 后，从4 个离心管中各取5 mL，装入4 个EP管中，作为BCS组。随后，将4个离心管剩余菌液高速离心处理（10 000 r/min、15 min），上清液移出装入4 个EP 管，作为CSS 组。同时，底层的悬浊液（＞600 μL）尽量移出，作为CBS 组。制备好的BCS 组、CSS 组、CBS组放于4 ℃冰箱中备用。

1.3.2 SDW组的制备

取4 等份无菌蒸馏水，置于灭过菌的EP 管中，分别调节pH 至2.5、4.0、5.5、7.0，作为SDW 组，于4 ℃冰箱中备用。

为了全面提高柳林县乡镇抗旱应急能力，保障严重干旱年城乡用水安全，推进构建与经济社会可持续发展相适应的抗旱减灾体系，为全县经济转型发展、跨越发展、和谐发展打造良好用水环境，提供有力水资源支撑，根据国家水利部组织编制的《抗旱规划实施方案（2013—2017年）》大纲和省、市水利部门统一安排，结合柳林县实际，县水利局制定了《柳林县抗旱规划实施方案》。

1.3.3 指示菌涂布平板的制备

指示菌涂布平板的制备参考前期报道[18]。3个指示菌猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌采用LB 培养基，有氧培养24 h。随后，从3 个指示菌培养液中各取800 μL，加入装有7.2 mL 蒸馏水的EP 管中。以上操作重复2 次，逐次稀释至10-2。进一步从10-2菌液中吸取200 μL，涂布于MRS 培养基平板上，每个指示菌涂3个平板。

平板静置15 min 后，即可用于抑菌圈直径（diameter of inhibition zone，DIZ）的测定。以上操作重复3次。

1.3.4 抑菌圈直径测定方法

每个平板上放置4 个牛津杯，牛津杯中依次加入的200 μL 的SDW、CSS、BCS、CBS，随后平板于37 ℃恒温培养箱中培养。12 h后取出平板，用游标卡尺测定DIZ值[15]。

以DIZ 值判定抑菌作用（见表1）[15]，评估主效应及次效应对凝结芽孢杆菌体外抑菌作用的影响，确定凝结芽孢杆菌牛津杯法体外抑菌试验的合理操作。

表1 抑菌作用的判定标准[15]

1.4 统计分析

同一个pH 条件下，对菌液处理的3 个处理组（BCS、CSS、CBS 组）及无菌蒸馏水的对照组（SDW组），进行抑菌圈直径数据的单因素方差分析和LSD多重比较；对同一处理组，在不同pH 条件下测定的抑菌圈直径数据，进行单因素方差分析和LSD 多重比较。统计软件为SPSS 21.0，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 BCS 组、CSS 组、CBS 组在不同pH 条件下对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用

由表2 和图1 结果可知，pH 4.0、5.5、7.0 条件下，BCS 组和CBS 组对猪霍乱沙门氏菌均有抑制作用，且CBS 组抑制效果显著大于BCS 组（P＜0.05）。CSS 组在pH 4.0 条件下，对猪霍乱沙门氏菌有抑制作用（敏感），但在pH 5.5 和7.0 时均无抑制作用（不敏感）。SDW 组在pH 4.0、5.5 和7.0 时，对猪霍乱沙门氏菌均无抑制作用（不敏感）。此外，pH 2.5条件下，4个处理组对猪霍乱沙门氏菌有强抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3 组之间抑制效果差异不显著，且抑制作用均显著大于SDW组（P＜0.05）。

图1 BCS组、CSS组、CBS组在不同pH条件下对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用

表2 BCS组、CSS组、CBS组在不同pH条件下对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用(DIZ值, mm)

2.2 BCS 组、CSS 组、CBS 组在不同pH 条件下对鸡白痢沙门氏菌的抑制作用

表3 和图2 结果可知，pH 4.0、5.5、7.0 条件下，BCS 组和CBS 组对鸡白痢沙门氏菌均有抑制作用（敏感），且CBS 组抑制效果显著大于BCS 组（P＜0.05）。CSS 组在pH 4.0 条件下，对鸡白痢沙门氏菌有抑制作用（敏感），但在pH 5.5 和7.0 时均无抑制作用（不敏感）。SDW 组在pH 4.0、5.5和7.0时，对鸡白痢沙门氏菌均无抑制作用（不敏感）。此外，pH 2.5条件下，4个处理组对鸡白痢沙门氏菌有强抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3组之间抑制效果差异不显著，且抑制作用均显著大于SDW组（P＜0.05）。

图2 BCS组、CSS组、CBS组在不同pH条件下对鸡白痢沙门氏菌的抑制作用

表3 BCS组、CSS组、CBS组在不同pH条件下对鸡白痢沙门氏菌的抑制作用(DIZ值，mm)

2.3 BCS 组、CSS 组、CBS 组在不同pH 条件下对大肠杆菌K88的抑制作用

表4 和图3 结果可知，pH 4.0、5.5、7.0 条件下，BCS 组和CBS 组对大肠杆菌K88 均有抑制作用（敏感），且CBS 组抑制效果显著大于BCS 组（P＜0.05）。CSS 组在pH 4.0 条件下，对大肠杆菌K88 有抑制作用（敏感），但在pH 5.5和7.0时均无抑制作用（不敏感）。SDW 组在pH 4.0、5.5 和7.0 时，对大肠杆菌K88 均无抑制作用（不敏感）。此外，pH2.5 条件下，4 个处理组对大肠杆菌K88 有强抑制作用（高敏感），BCS、CSS、CBS 3 组之间抑制效果差异不显著，且抑制作用均显著大于SDW组（P＜0.05）。

图3 BCS组、CSS组、CBS组在不同pH条件下对大肠杆菌K88的抑制作用

表4 BCS组、CSS组、CBS组在不同pH条件下对大肠杆菌K88的抑制作用(DIZ值, mm)

3 讨论

现有凝结芽孢杆菌体外牛津杯抑菌试验报道中，大部分操作是将凝结芽孢杆菌培养液（BCS）直接注入牛津杯，检测抑菌圈直径来表征抑菌作用的强弱[16-20]，但少量报道是用培养液的离心上清液(CSS)注入牛津杯，检测抑菌圈直径[21-23]。鉴于这一试验操作差异，刘冬梅等[11]和林松泉等[12]比较了凝结芽孢杆菌培养液(BCS)及其离心处理的上清液(CSS)、菌悬液(CBS)抑菌效果差异。刘冬梅等[11]研究显示，凝结芽孢杆菌抑菌性能“CSS组显著强于CBS组，CSS＞CBS”；林松泉等[12]进一步报道，凝结芽孢杆菌抑菌性能“CSS＞BCS＞CBS”。以上结果与本研究凝结芽孢杆菌对3 个指示菌的综合（pH 为4.0～7.0）抑菌性能“CBS组＞BCS组＞CSS组”矛盾。

很多试验研究证明，凝结芽孢杆菌培养液中含有多种高分子抗菌蛋白和（或）肽类抑菌物质[9-10，24]，是凝结芽孢杆菌发挥抑菌作用的关键。众所周知，培养液中均匀分布的蛋白质或肽类物质，在高速离心作用下，会更多地向离心管底部聚集。因此，理论上若仅考虑凝结芽孢杆菌所分泌的抗菌蛋白或抗菌肽浓度对抑菌性能的影响，抑菌性能“CBS＞BCS＞CSS”是合理的，这也与本试验主效应的研究结果相符。此外，考虑到离心操作设备及参数带来的可能差异，本研究建议直接用培养液（BCS）开展凝结芽孢杆菌牛津杯体外抑菌试验。

除高分子抗菌蛋白和（或）肽类抑菌物质外，凝结芽孢杆菌同时分泌乳酸等多种低分子有机酸，也可能是凝结芽孢杆菌体外抑菌、体内调控肠道菌群的作用机制之一[13-14，25]。有机酸中H+能降低pH，理论上有抑制肠道有害菌增殖的作用。鉴于此，本试验次效应研究，实测了该株凝结芽孢杆菌培养液pH 为4.7 后，将培养液进一步调整为pH 2.5（胃环境）及4.0、5.5、7.0（肠道环境），模拟畜禽胃肠道pH环境，评估H+对凝结芽孢杆菌抑菌性能的影响，为饲用凝结芽孢杆菌对畜禽胃肠道菌群的调控效果提供支撑。综合对猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌K88等3个指示菌的抑菌结果显示，pH 调整为4.0、5.5、7.0 对培养液（BCS）的抑菌性能无显著影响，且pH 4.0、5.5、7.0对菌悬液（CBS）的抑菌性能也无显著影响。以上结果表明，饲用凝结芽孢杆菌在畜禽肠道pH 范围内，其抑菌性能不受pH影响；基于饲用凝结芽孢杆菌在肠道内分泌的各类有机酸，被食糜、消化器官分泌液等不同程度地缓冲，以上结果进一步提示，“产酸抑菌”不是饲用凝结芽孢杆菌调控畜禽肠道菌群的主导机制。

此外，综合3 个指示菌的抑菌结果均显示，培养液组（BCS）pH 2.5 时的抑菌圈直径（DIZ=23.82～25.09，高敏感）几乎是pH 4.0～7.0 时测定结果（DIZ=11.08～14.54，敏感）的约2 倍，由于培养液中主导抑菌作用的抗菌蛋白或抗菌肽含量恒定，这一变化显然是高浓度H+造成的。为验证这一观点，本研究对照组无菌蒸馏水（SDW 组），先用乳酸将pH 调整为至2.5，检测SDW 对3个指示菌抑制作用也达到了“高敏感”；随后，用氢氧化钠降低SDW 中的H+、将pH 调整为4.0、5.5 和7.0 时，检测SDW 对3 个指示菌均无抑制作用。由于该株凝结芽孢杆菌培养液实测pH 为4.7，因此以上的结果证明“产酸抑菌机制”不是饲用凝结芽孢杆菌调控胃肠道菌群的主导机制。

综上所述，用牛津杯法体外评估凝结芽孢杆菌抑菌性能时，凝结芽孢杆菌培养液和菌悬液均可用于反映凝结芽孢杆菌的抑菌性能，但培养液操作更方便。同时模拟畜禽肠道pH 环境发现，凝结芽孢杆菌抑菌性能不受pH影响。

4 结论

本研究表明，凝结芽孢杆菌的培养液适合用于牛津杯抑菌试验操作。进一步通过模拟畜禽肠道的不同pH 条件（pH 4～7），发现用凝结芽孢杆菌培养液评估的抑菌性能（抑菌圈直径数据）差异不显著。以上研究结果为规范凝结芽孢杆菌体外牛津杯抑菌试验操作、进一步阐明抑菌机制提供了科学依据。