芩蓟凉血合剂对痔病相近动物模型的影响

周蒙恩，李鹏，金文琪，王若琳，郭修田

（上海中医药大学附属市中医医院肛肠科，上海 200071）

痔是临床最常见的肛门直肠疾病之一，我国成人肛肠疾病的患病率50.10%，其中98.09%的患者具有痔疮症状[1]。 在美国，痔是第三常见的门诊胃肠诊断，患病率范围从4.4% ～40%，每年造成近400 万次医院就诊，导致巨大的经济成本和个人痛苦[2-4]。 痔最常见的表现是排便时无痛性直肠出血，伴或不伴肛门组织脱垂[5]。 而对其确切病理生理学知之甚少，主流理论认为痔是由血管的异常扩张和扭曲以及支撑结缔组织的肛垫的破坏性变化引起的[6]。 其早期症状通常采用非手术方式治疗，当非手术治疗无效时，通常选择手术治疗[7]，但手术后出现的排便困难、顽固性疼痛、大出血等并发症让患者心生恐惧[2]。 从消除或减轻症状出发，痔病最常用的治疗方法是药物治疗[8]。 西医一般使用静脉活性药物类黄酮来改善静脉张力，稳定毛细血管通透性和增加淋巴引流，进行痔出血治疗[9-10]。而中医对痔的认识由来已久，可以缓解痔病患者的症状，在药物保守治疗方面优势突出[11]。 芩蓟凉血合剂为上海市中医医院院内制剂，具有清热凉血、收敛止血、散瘀消痈等功效，临床疗效显著，但是临床提供的依据有限，因此，本研究通过建立急性痔病模型，旨在探讨其治疗抗痔的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

80 只SPF 级雌性SD 健康大鼠，7 周龄，体重180 ～200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK（沪）2022-0004】，24 只SPF 级C57BL／6雄性健康小鼠，6 周龄，体重18 ～20 g，购自上海杰思捷实验动物有限公司【SCXK（沪）2023-0004】，大鼠和小鼠均饲养于上海市中医医院动物实验室【SYXK（沪）2020-0014】，饲养环境：昼夜各半循环照明，湿度控制在40% ～70%，温度控制在22 ～25 ℃， 本研究经过上海市中医医院伦理委员会批准（IACUC-2023002）。

1.1.2 主要试剂与仪器

巴豆油（C12229973，上海麦克林生化），吡啶（C865142，上海麦克林生化），乙醚（20210716，国药化学试剂有限公司），乙酸（20080913，上海强顺化工），地奥司明（H2005471，南京郑达天晴制药），肾上腺色腙片（H32023286，江苏亚邦爱普森药业），IL-6 （ 20220926-30219B， 上海酶联）， TNF-α（20220926-31063B，上海酶联），苏木素染色液（22040716，中杉金桥生物技术），伊红染色液（22062319，中杉金桥生物技术）。 芩蓟凉血合剂（Qinji Liangxue mixture，QLM）已在上海市药品监督管理局（备案号：沪药制剂字： Z20210039000。 执行标准： SYZ-ZF-217-2005），由上海市中医医院药剂科提供（药物组成：地黄、大蓟草、黄芩、火麻仁、茜草（炭）、地榆（炭）、槐角（炭）、侧柏叶（炭）、仙鹤草、甘草（蜜炙），比例为3 ∶4 ∶4 ∶4 ∶3 ∶3 ∶3 ∶3 ∶5 ∶1。

RM2016 病理切片机（Leica，德国），生物组织摊烤片机（YT-6C，亚光医用电子技术），防脱载玻片（P031IH，湖南艾佳生物科技），鼓风干燥箱（DHC-9070A，天津津立仪器设备科技），光学显微镜（AE41，麦克奥迪实业集团）。

1.2 方法

1.2.1 巴豆油诱导急性痔疮模型

巴豆油制剂（croton oil preparation，COP）由去离子水、吡啶、乙醚和6%巴豆油按1 ∶4 ∶5 ∶10 的比例配制而成。 将40 只SD 大鼠分为5 组，每组8 只，在使用COP 之前，大鼠禁食1 夜，将浸有160 μL COP 无菌棉签（直径4 mm），插入研究动物的肛门（肛门直肠部分，距离肛门20 mm），并保持10 s[12]。诱导后24 h，各组的动物被灌胃治疗7 d，药物的剂量根据《药理实验方法》[13]进行换算。 分组如下：对照组1（CA 组），模型组1（CB 组），QLM 低剂量组1-1（CC 组）：4.45 g／（kg·d），QLM 高剂量组1-2（CD 组）：17.8 g／（kg·d），地奥司明组1（CE 组）：100 mg／（kg·d）。 除了CA 组外，其他组均使用COP处理，CA 组及CB 组给予等量生理盐水。

1.2.2 冰醋酸诱导急性痔疮模型

将40 只SD 大鼠分为5 组，每组8 只，在冰醋酸诱导急性痔病模型之前，大鼠禁食1 夜，将直径6 mm 滤纸片浸泡于99.0%醋酸溶液中，将浸泡后的滤纸片放到大鼠肛门周围，使滤纸片紧密接触肛周皮肤及黏膜，每次用滤纸1 片，每只鼠于0.5、1 min时换1 次滤纸片，共更换2 次[14]。 诱导后24 h，各组的动物被灌胃治疗7 d，药物剂量根据《药理实验方法》[13]进行换算。 分组如下：对照组2（GA 组），模型组2（GB 组），QLM 低剂量组2-1（GC 组）：4.45 g／（kg·d），QLM 高剂量组2-2（GD 组）：17.8 g／（kg·d），地奥司明组2（GE 组）：100 mg／（kg·d）。 除了GA 组外，其他组均使用冰醋酸处理，GA 组及GB 组给予等量生理盐水。 结束后对大鼠肛门溃疡的最大直径进行测量，并计算溃疡面积［溃疡面积（mm2） ＝ π（最大直径／2）2］。

1.2.3 小鼠分组及给药

将24 只C57BL／6 小鼠分为4 组，药物剂量根据《药理实验方法》[13]进行换算：对照组（A 组）：等量生理盐水；QLM 低剂量组（B 组）：6.4 g／（kg·d）；QLM 高剂量组（C 组）：25.6 g／（kg·d）；肾上腺色腙片组（D 组）：1.5 mg／（kg·d）；连续灌胃7 d。

1.2.4 肛门直肠组织病理学评估

大鼠肛门直肠组织先使用4%多聚甲醛固定，再经过包埋、切片进行HE 染色，然后进行封片镜检。 观察巴豆油诱导的SD 大鼠肛门直肠组织病理学形态，参照文献[14]并进行分级评分：“-”肛门直肠黏膜上皮正常记为0 分；“ ＋”肛门直肠黏膜上皮部分变性，伴有少量炎性细胞浸润记为1 分；“＋＋”肛门直肠黏膜上皮部分变性、排列紊乱，黏膜下见大量炎性细胞浸润记为2 分；“＋＋＋”肛门直肠黏膜上皮部分变性、缺损、坏死，黏膜下见大量炎性细胞浸润，结缔组织增生记为3 分。

1.2.5 血清炎症因子检测

按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，测定各组大鼠血清IL-6、TNF-α 水平。

1.2.6 止血疗效评估

参照文献[15-16]使用毛细玻管法检测凝血时间，小鼠断尾法测出血时间，对QLM 的止血疗效进行评价。

毛细管法测凝血时间：在末次给药后1 h，用毛细玻璃管从小鼠内眼球的后静脉丛中取血。 当血液充满玻璃管时，立即计时。 每隔30 s 将两端的玻璃管（约5 mm）折断，慢慢左右拉动，观察破裂处是否有血凝块。 从血液充满玻璃管到出现血凝块的时间为凝血时间。

小鼠断尾法测出血时间：末次给药后1 h，将小鼠麻醉，距离小鼠尾尖5 mm 处剪断，立即开始计时，每30 s 用滤纸擦拭断尾直至滤纸上无血为止，经过的时间为出血时间。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0、Graphpad Prism 8 软件进行统计分析、作图，计量资料符合正态分布且方差齐，采用平均值± 标准差（±s）描述，差异比较采用t检验；不符合正态分布和方差不齐，采用中位数（上四分位数，下四分位数）［M （P25， P75）］表示，差异比较采用秩和检验；计数资料比较采用χ2检验；等级资料采用秩和检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 QLM 对COP 诱导的大鼠痔病模型病理形态学的影响

由图1 可见，CA 组大鼠肛门直肠区组织结构正常；CB 组大鼠结直肠区黏膜严重糜烂、破损，伴有明显的炎性浸润，鳞状上皮化生，黏膜下层水肿明显，血管扩张明显；CC 组的组织病理学显示明显的黏膜上皮再生，中度的脱屑和变性，较少的炎症浸润，较少的血管扩张，并且没有明显的充血和出血；CD 组的组织病理学显示黏膜结构完整，上皮细胞和内分泌细胞排列有序，黏膜下微血管不充血；CE 组黏膜上皮明显再生，结构较完整，轻度脱屑变性，炎症浸润血管扩张明显减少，未见明显充血出血。

2.2 QLM 对COP 诱导的大鼠痔病模型病变程度评分的影响

如表1 所示，与CA 组相比，CB 组病变程度评分显著升高（P＜0.05），与CB 组相比，QLM 治疗后能够显著降低其病变程度评分（P＜0.05）。

表1 QLM 对COP 诱导的大鼠痔病模型病变程度评分的影响［M （P25， P75），n ＝8］Table 1 Effect of QLM on the pathological grade score of rat hemorrhoid model induced by COP ［M （P25， P75），n ＝8］

2.3 QLM 对COP 诱导的大鼠痔病模型炎症因子的影响

如表2 所示，与CA 组相比，CB 组IL-6、TNF-α水平显著升高（P＜0.05），与CB 组相比，QLM 治疗后能够显著降低IL-6、TNF-α 水平（P＜0.05）。

表2 QLM 对COP 诱导的大鼠痔病模型IL-6、TNF-α 的影响（± s，n ＝8）Table 2 Effect of QLM on IL-6、TNF-α in COP-induced hemorrhoids model in rats（± s，n ＝8）

表2 QLM 对COP 诱导的大鼠痔病模型IL-6、TNF-α 的影响（± s，n ＝8）Table 2 Effect of QLM on IL-6、TNF-α in COP-induced hemorrhoids model in rats（± s，n ＝8）

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2.4 QLM 对冰醋酸诱导的大鼠痔病模型病理形态学的影响

如图2 所示，GA 组肛周组织结构正常，GB 组肛周组织纹理紊乱、糜烂、缺损、水肿，黏膜与肌层分离，伴有大量炎性细胞浸润及毛细血管扩张；GC组肛周组织糜烂、缺损、水肿较明显减轻，炎性细胞浸润减少，未见明显毛细血管扩张；GD 组及GE 组肛周组织未见明显缺损、水肿及炎性浸润。

图2 QLM 对冰醋酸诱导的大鼠痔病模型病理形态学的影响Figure 2 Effect of QLM on pathomorphology of rat hemorrhoid model induced by glacial acetic acid

2.5 QLM 对冰醋酸诱导的大鼠痔病模型肛周溃疡面积的影响

如表3 所示，与GA 组相比，GB 组肛周溃疡面积显著升高（P＜0.05），与GB 组相比，QLM 治疗后能够显著降低其肛周溃疡面积（P＜0.05）。

表3 QLM 对冰醋酸诱导的大鼠痔病模型肛周溃疡面积的影响（± s，n ＝8）Table 3 Effect of QLM on perianal ulcer area of rat hemorrhoids model induced by glacial acetic acid（± s，n ＝8）

表3 QLM 对冰醋酸诱导的大鼠痔病模型肛周溃疡面积的影响（± s，n ＝8）Table 3 Effect of QLM on perianal ulcer area of rat hemorrhoids model induced by glacial acetic acid（± s，n ＝8）

注：与GA 组相比，aP ＜0.05；与GB 组相比，bP ＜0.05。Note. Compared with group GA， aP ＜0.05. Compared with group GB，bP ＜0.05.

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2.6 QLM 止血疗效评价

使用毛细管法和小鼠断尾法对QLM 止血效果进行评价，结果显示QLM 可以显著缩短凝血时间、出血时间（P＜0.05），见表4。

表4 QLM 止血疗效评价（± s，n ＝6）Table 4 Evaluation of QLM hemostasis effect（± s，n ＝6）

表4 QLM 止血疗效评价（± s，n ＝6）Table 4 Evaluation of QLM hemostasis effect（± s，n ＝6）

注：与A 组相比，cP ＜0.05。Note. Compared with group A， cP ＜0.05.

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3 讨论

我国对痔的认识可以追溯到夏商时期，最早出现在非医学典籍《山海经》[17]。 中医学对痔病病因病机的认识由来已久，《素问·生气通天论》最早有“因而饱食，筋脉横解，肠澼为痔”的记载。 后世进一步概括为脏腑本虚，饮食劳逸，导致脏腑功能失调，风湿燥热下迫大肠，瘀阻魄门，瘀血浊气结滞不散，筋脉纵横而成痔；临床上分为治疗上以清热利湿，凉血止血，活血祛风，补中益气等为主[18]。

前期临床研究发现QLM 能有效缓解出血性痔疮患者大便带血的症状，改善痔疮黏膜充血、缩小痔疮体积等，有效干预痔疮的临床进展，降低住院手术比例，改善患者的生活，治疗期间无明显副作用[19-21]。 其中大蓟草凉血止血，散瘀解毒消痈为君药，现代药理学研究发现大蓟有效成分具有抗炎、止血等作用[22-23]。 黄芩清热燥湿，泻火解毒，凉血止血依为君药，现代药理学研究发现黄芩有效成分具有良好的抗炎、抗氧化、免疫调节以及心脑血管保护等作用[24]。 生地黄为治热入营血之要药，可以清热凉血止血，与大蓟、黄芩同为君药。 现代药理学研究发现地黄具有抗炎、止血、抗氧化等作用[25]。地榆（炭）、侧柏叶既能凉血止血，又能收敛止血为臣药。 现代研究发现地榆、侧柏叶中的有效成分具有抗炎止血、抗氧化、抗菌等多种药理活性[26-27]。槐角（炭）凉血止血，清肠疏风，仙鹤草收敛止血，意在加强收涩止血治标之功，共为“臣药”。 现代药理学研究发现槐角具有止血、抗炎等作用[28]，仙鹤草具有抗炎、抗氧化等作用，同时具有抗凝促凝双重特性[29]。 此外，凉血止血药易于凉遏恋邪，有止血留瘀之弊。 茜草（炭）味苦性寒，功能凉血止血，祛瘀通经。 现代药理学研究发现茜草具有良好的化瘀止血作用[30]。 治疗急性出血同时，具有化瘀的作用，起到止血不留瘀，祛瘀生新血的疗效。 火麻仁为“佐药”，与生地、槐角相配功能润肠通便，缓解长期出血的痔病患者血燥津亏，引起的便秘症状。 甘草调和药性，缓和诸药之寒，顾护脾胃阳气，是为“使药”。 诸药合用共达凉血止血，清热祛风，散瘀消痈，润肠通便等功效的功效。

有研究报道在痔组织血管壁及周围结缔组织发现严重炎症反应[31]。 国内学者通过对380 例痔病患者痔组织进行病理学检查发现195 例痔组织中存在慢性炎症[32]。 免疫组化[33-34]分析也发现痔组织中IL-6、TNF-α 等炎症因子表达水平升高，这提示炎症因子可能参与了痔病的发生发展。 本课题组通过综述近年来中药复方或草药制剂治疗痔病的机制[35]，发现抑制炎症因子也是其治疗痔病的机制之一。 一些中药复方如加味补中益气汤[36]可以很好的改善痔相近动物模型出血、局部溃疡及水肿状况；ZHANG 等[37]能够降低COP 诱导的痔病动物模型炎症因子水平，减轻组织损伤；生姜外用可以减轻大、小鼠痔病模型肛周肿胀及溃疡程度[38]；银芷颗粒熏洗剂可以缓解急性痔病模型症状，具有良好的抗炎、镇痛、止血作用[39]。 此外，国外一些研究发现葡萄叶醇提物、魔芋块茎以及茄子也具有良好的抗痔活性，可能与其抗炎、抗氧化、降低血清炎症因子等作用密切相关[40-42]。

本研究按照《中药痔疮动物模型制备规范（草案）起草说明》[14]使用COP 诱导了大鼠肛门肿胀模型，使用冰醋酸诱导了大鼠肛门溃疡模型，QLM 治疗后能够显著改善COP、冰醋酸诱导的大鼠肛门直肠病理损伤，降低COP 诱导的大鼠痔病模型病变程度评分，IL-6、TNF-α 水平以及冰醋酸诱导的大鼠肛周溃疡面积。 此外，使用毛细管法测凝血时间，小鼠断尾法测出血时间，发现了QLM 显示出良好的止血疗效。 因而，QLM 具有的抗痔活性，其作用可能是通过抗炎、止血、减少组织损伤实现的。