基于TLR4／MyD88／NF-κB 通路探讨美洲大蠊虫粉对脊髓损伤大鼠的保护作用

李杰，周邦瑜，马彦博，阮玉山，李绍波∗

（1. 大理大学临床医学院，云南大理 671000；2. 大理大学第一附属医院，云南大理 671000）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种高病死和高致残的中枢神经系统疾病，给患者、家庭和社会造成巨大负担[1]。 研究发现，脊髓损伤后，损伤局部会继发性产生大量炎性因子，募集血液中单核细胞和巨噬细胞到脊髓损伤区域，产生自身抗体、趋化因子、活性氧和氮等物质，破坏脊髓微环境，导致神经细胞调亡或坏死，轴突再生抑制，神经和运动功能长期或永久丧失[2]。 因此，减少炎性因子产生是治疗脊髓损伤的有效切入点。 TOLL 样受体4 （toll-like receptors， TLR4）-髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）-核因子-κB（NF-κB）通路是调控继发性炎症反应的重要通路之一，抑制TLR4／MyD88／NF-κB 通路可以减少炎症反应，有利于神经和运动功能恢复[3]。

美洲大蠊最早被记录于《神农本草经》中，其具有消肿、通淤、利咽的作用[4]。 现代研究表明美洲大蠊制剂在治疗胃溃疡[5]、肝纤维化[6]、脂肪性肝炎[7]、心肌损伤[8]等多种疾病时，通过抑制TLR4 通路发挥抗炎作用。 本课题组前期已证明美洲大蠊虫粉可通过影响自噬促进脊髓损伤恢复[9]，但其抗炎作用是否对脊髓损伤有效尚未可知。

相关地，同一知识点螺旋重复多少次合适？比如，“平行四边形概念”在4个版本中出现了3次，2个版本出现了4次．“性质1”在北师版中没有重复，冀教版中出现了3次，其余版本出现了2次．“性质2”在冀教版和青岛版中出现了2次，其它4个版本均没有重复出现．冀教版中的“知识点Z9”出现了2次，分别在二下、四下，其它5个版本均没有重复出现．

因此，本研究通过给予脊髓损伤的大鼠美洲大蠊虫粉治疗，以验证其在脊髓损伤后是否可以通过调节TLR4 通路发挥抗炎作用，促进损伤恢复。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

48 只SPF 级健康雌性SD 大鼠，8 周龄，体重200 ～220 g， 购买于北京华阜康生物科技股份有限公司【SCXK（京）2019-0008】。 饲养在大理大学动物实验中心【SYXK（滇）2018-0002】，条件：12 h 明暗交替，温度20 ～25 ℃，湿度40% ～70%。 适应1周时间后进行实验。 本动物实验已获大理大学动物伦理审查会的批准（2023-PZ-114）。

脊髓损伤模型构建：戊巴比妥钠麻醉大鼠后切开背部皮肤和肌肉，咬除T10 棘突、椎板、上下关节突关节，充分暴露脊髓。 剪断左侧T10 脊髓，此时大鼠左后肢会出现抽搐，表示脊髓半横断损伤造模成功[14-15]。 假手术组仅咬除T10 椎板。 术后给予头孢呋辛钠（90 mg／kg）预防感染，每天1 次，连续3 d。膀胱按摩，每天2 次，直至可自主排尿。 术后第14天，分别进行心脏灌注和新鲜脊髓组织取材，用作后续实验。

假手术组组织无损伤，神经元数量最多，染色均匀。 盐水组神经元数目减少明显，内部结构模糊不可辨别。 美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组神经元数目较多，部分染色好的神经元可以看到环绕在外围的尼氏体结构。 见图3。

1.2 方法

1.2.1 分组与造模

将48 只雌性SD 大鼠随机分为4 组：假手术组、盐水组、美洲大蠊虫粉组、TLR4 抑制剂组，每组12只。 盐水组给予5 mL 生理盐水灌胃，美洲大蠊虫粉组给予等体积美洲大蠊虫粉（630 mg／kg，此浓度基于前期的探索与既往文献报道[10-11]）灌胃，TLR4 抑制剂组给予TLR4 抑制剂（3 mg／kg）腹腔注射处理[12-13]，每天1 次，连续14 d。 假手术组不做处理。

1.1.2 主要试剂与仪器

可证该式关于s1的二阶偏导数小于0，存在最大值，求该式关于s1的一阶偏导，并令其为0，得到企业1最优续航里程研发水平同理可得，企业2最优续航里程研发水平

1.2.2 BBB 运动功能评分

术后1、3、7、14 d 由2 名熟知评分标准但不知道分组情况的评估者进行大鼠后肢髋、膝、踝关节活动度和协调性评分，每次5 min，取平均值。 评分越高运动功能恢复越好[16]。

1.2.3 苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色观察组织形态

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1.2.4 免疫组化

制片同HE 染色。 使用柠檬酸高压修复抗原，山羊血清封闭，滴加一抗NeuN（1 ∶10 000），37 ℃孵育60 min，滴加约50 μL 即用型二抗，室温孵育30 min，显色，封片，采图。

工科新教师培训动机缺失的直接结果是：不能够将学科知识有效转化为课程知识，不能够将课程知识与工程经验转化为教学内容，不能够将教学知识内化为教育思想或教育理念，不能够将听、说、读、写、交流等基本能力转化为教学设计、教学组织与实施、教学评价的能力等。

1.2.5 酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测炎性因子

严格按照ELISA 试剂盒的说明书在酶标仪450 nm 检测脊髓组织中IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 的表达水平。

以脊髓损伤灰质与白质交界为中心，选取相同区域，假手术组灰质和白质分界清晰、结构紧密、细胞形态完整。 盐水组损伤最重，脊髓灰质后角与白质界限不清，细胞数量减少，细胞核出现明显固缩、碎裂。 美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组形态相对完整，灰白界限大致清楚，观察到完整的细胞数目较盐水组更多。 如图2。

取新鲜脊髓组织研磨后加入RIPA 液裂解30 min，每孔10 μL 样品上样，电泳（80 V 20 min，120 V 100 min），湿转（恒流400 mAh、转膜15 min）。 5%脱脂牛奶封闭1 h，分别按照1 ∶3000、1 ∶1000、1 ∶1000、1 ∶ 5000 稀释TLR4、MyD88、 NF-κB p65、β-actin 抗体，4 ℃过夜。 山羊抗兔二抗稀释比例为1 ∶5000， 孵育、显影。

将灌注的脊髓组织依次进行石蜡包埋，切片，烤片，苏木素、伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜采图。

1.3 统计学分析

使用SPSS 20.0 软件分析，计量资料以平均值± 标准差（±s）表示。 多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验，P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

图2为ATmega16最小系统电路图，包括晶体振荡器电路、手动复位电路、3.3～5V切换电源电路、ISP下载电路和JTAG仿真电路。

2 结果

2.1 大鼠术后一般状况

假手术组大鼠手术耐受性好，麻醉恢复后可正常活动。 盐水组、美洲大蠊虫粉组、TLR4 抑制剂组术后精神状况差，少部分大鼠出现血尿、尿潴留和肠梗阻等症状，给予腹部按摩、抗感染等治疗后有所缓解，极少部分出现死亡。 其中盐水组和TLR4抑制剂组因血尿各死亡1 只，美洲大蠊虫粉组因肠梗阻死亡1 只，考虑造成死亡的原因与泌尿系统、消化系统感染相关，也有可能与大鼠个体对损伤耐受程度不同相关。 动物造模成功率为93.75%。

2.2 BBB 运动功能评分

如图1 所示，假手术组BBB 评分保持在21 分，其余3 组均有不同程度的运动功能下降（P＜0.05）。 术后第1 天和第3 天，盐水组、美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组之间无统计学意义。 术后第7 天和第14 天，与盐水组相比，美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组评分较高（P＜0.05），术后第14 天，美洲大蠊虫粉组比TLR4 抑制剂组出现更频繁的协调运动，评分高于TLR4 抑制剂组，差异有统计学意义。

图1 各组术后不同时间BBB 运动评分Note. Compared with saline group，∗P ＜0.05. Compared with Periplaneta americana powder group， ＄P ＜0.05. （The same in the following figures and tables）Figure 1 BBB score at different time after operation in each group

2.3 HE 观察脊髓组织形态

1.2.6 Western Blot 检测蛋白表达

不同溶剂提取黄连，提取的成分明显不同。根据性相近则相容的原则，水提物含有多糖、蛋白质、氨基酸、多酚、生物碱、木质素等成分，而无水乙醇提取物中，多糖、蛋白质等大分子物质几乎未被提出，主要是小分子有机物，含水醇提物的成分介于二者之间。从上述结果看，对2种试验菌有抑菌活性的主要是小分子的有机物。为进一步了解黄连抗菌活性成分，用化学方法把黄连分成不同极性组分。

图2 各组术后HE 染色结果比较Figure 2 Comparison of HE staining results after operation in each group

2.4 免疫组化神经元改变结果

美洲大蠊虫粉（药用美洲大蠊四川省重点实验室，批号：221001），TLR4 抑制剂（MCE，HY-11109），白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） （ 上海酶联生物（ 国产） YJ037373，YJ102828， YJ002813， YJ002859 ）， TLR4 抗体（Abcam， ab217274 ）、 MyD88 抗体 （ Abclonal，A19082）、 NF-κB p65 抗体（Affinity Biosciences，AF5006）、山羊抗兔IgG 抗体（proteintech，SA00001-2）、NeuN 抗体（Proteintech，26975-1-AP-50），RIPA裂解液（Solarbio，批号：R0010），BCA 试剂盒（碧云天，批号：P0012）。 显微镜（奥林巴斯BX53 型），酶标仪（Infinite M Nano 200 PRO），蛋白印迹检测系统（Bio-Rad ChemiDocMP）。

通过以上分析，综合考虑研究区域的实地调研数据与视域分析结果，结合空间句法的理论，从可持续发展的角度出发，对中山路教堂广场区域的改造更新提出以下几点建议.

图3 各组术后免疫组化和神经元数目统计图Note. A. Immunohistochemistry in each group. B. Statistics of the number of neurons. Compared with sham operation group， ＃P ＜0.05. （The same in the following figures and tables）Figure 3 Statistics of immunohistochemistry and neuron number after operation in each group

2.5 ELISA 测定炎性因子变化

与假手术组相比，盐水组、美洲大蠊虫粉组、TLR4 抑制剂组中TNF-α 与IL-1 均有所升高（P＜0.05）。 与盐水组相比，美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组TNF-α、IL-1 减少，而且美洲大蠊虫粉组中含量下降比TLR4 抑制剂组更显著（P＜0.05）。 盐水组中IL-6 比假手术组有所升高，给予美洲大蠊虫粉和TLR4 抑制剂治疗后下降（P＜0.05），美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组之间无明显差异（P＞0.05）。IL-10 在4 组中无统计学意义（P＞0.05）。 如表1。

表1 各组术后4 个炎性因子表达量（pg／mL）Table 1 Expression of four inflammatory factors after operation in each group（pg／mL）

2.6 Western Blot 结果

与假手术相比，盐水组中TLR4、MyD88 以及NF-κB P65 蛋白表达显著升高，与盐水组相比，美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组下调了这3 个蛋白的表达（P＜0.05）。 美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组表现一致，无统计学意义（P＞0.05）。 如图4。

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图4 各组术后3 个通路蛋白变化Figure 4 Changes of three pathway proteins after operation in each group

3 讨论

TLR4／MyD88／NF-κB 信号通路是免疫系统中一条重要的信号传导通路，在炎症调节中起关键作用[17]。 在此通路中，TLR4 作为模式识别受体，当感知细菌、病毒、损伤等信号分子后，激活下游MyD88分子，接着使NF-κB 抑制酶发生磷酸化，诱导并促使NF-κB 进入细胞核[18]。 激活的NF-κB 调控一系列炎症基因的转录，包括炎症因子和炎症相关的酶，以发挥免疫应答和炎症调节的作用[19]。

美洲大蠊虫粉是将美洲大蠊置55 ～65 ℃热水中淹死、漂洗、沥干、烘干后研磨成粉，有效成分为糖类、肽类以及氨基酸，因其良好的抗炎作用被临床工作者用于治疗呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统以及皮肤黏膜损伤[20]。 有研究表明，其抗炎作用与抑制TLR4 通路有关。 美洲大蠊提取物能抑制炎症细胞因子（IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α）以及TLR4通路蛋白TLR4、MyD88、NF-κB 表达，减轻胃粘膜损伤[5]。 另外，在治疗脂肪性肝炎中，美洲大蠊制剂可以减少TLR4 通路上游的高迁移率族蛋白B1 表达，阻断TLR4 通路，抑制促炎型巨噬细胞表达，减少炎症反应[7]。 美洲大蠊提取物还能通过抑制炎症，氧化应激减少神经细胞调亡[21]，但是否与抑制TLR4 通路有关暂无报道。

脊髓损伤是一种严重的致残性疾病，会造成患者感觉和运动功能丧失，而且随着经济发展和生活方式改变，患病率逐年增加[22]。 虽然经过手术、药物、康复等治疗有所改善，但总体效果仍不理想[23]。文献表明，脊髓损伤患者血液中TLR4、MyD88 以及NF-κB 明显高于健康对照组，而且在脊髓完全损伤患者中的表达高于不完全损伤组，提示损伤越重，TLR4 通路越活跃[24]。 细胞和动物实验中也发现脊髓损伤后会激活TLR4 通路，促进炎性因子IL-1、IL-6、 TNF-α 等的释放[3，25]。 因此抑制TLR4 通路激活，有助于脊髓损伤恢复。

本研究通过构建大鼠脊髓损伤模型，研究美洲大蠊是否可以在脊髓损伤后通过抑制TLR4 通路发挥抗炎作用，结果表明，美洲大蠊虫粉可以促进脊髓损伤大鼠运动功能恢复，改善脊髓组织破坏情况，减少神经细胞死亡数量，减少炎性因子IL-1、IL-6、 TNF-α 的含量，表明了美洲大蠊虫粉在脊髓损伤后发挥了抗炎作用，有利于脊髓损伤恢复。 值得注意的是，研究发现IL-10 在损伤后14 d 时无明显改变，这可能与脊髓损伤后抗炎因子IL-10 分泌持续时间比促炎因子短有关。 关于IL-10 在脊髓损伤后具体动态变化研究较少，有文献报道IL-10 在脊髓损伤后2 周内有先升高后下降的趋势，在第7 天时到达高峰[26-27]。 因此，需要在损伤早期检测IL-10 的变化。 另外，通过Westem Blot 对TLR4 通路蛋白的研究发现，脊髓损伤后TLR4、MyD88、NF-κB P65 的表达明显增高，这与既往研究相一致。 给予美洲大蠊虫粉和TLR4 抑制剂治疗后，脊髓组织中TLR4、MyD88、NF-κB P65 的表达下降，其中美洲大蠊虫粉组和TLR4 抑制剂组在下调TLR4、MyD88、NF-κB P65 的表达中效果相同，证明美洲大蠊虫粉有抑制TLR4 通路，减少继发性炎症反应的作用。

由于我国人口结构不断发生改变，导致冠心病的发病率呈上升趋势发展，冠心病若未能够得到有效治疗能够使患者的生命安全受到威胁，通过尽早诊断使患者的生存质量得以改善，目前临床中将冠脉造影检查作为诊断冠心病的诊断金标准，但该种诊断方式具有创伤性、价格相对较高，部分家庭难以接受，因此，该种诊断方式很难在临床中广泛应用[2]。

综上所述，美洲大蠊虫粉能促进脊髓损伤大鼠的运动和神经功能恢复，其机制与抑制TLR4／MyD88／NF-κB 通路， 降低炎症因子IL-1、 IL-6、TNF-α 的释放，减轻炎症反应有关。 本研究为美洲大蠊应用于临床治疗脊髓损伤提供了实验依据，但美洲大蠊虫粉中具体何种物质发挥了抗炎作用仍需进一步研究。