基于网络药理学和分子对接分析车前草防治畜禽腹泻的作用机制

韦国旺,黄甫克,胡湘云,盛 双,韦良炬,韦宣亦

(1.广西河池市科学技术情报研究所,广西 河池 547000 ; 2. 广西农业职业技术大学畜牧研究院,广西 南宁 530007 ; 3. 广西河池市技术开发中心,广西 河池 547000 ; 4. 广西河池市技术市场服务中心,广西 河池 547000)

畜禽腹泻是由多种病因(病毒性、细菌性、寄生虫性等)引起的常见肠道性疾病,其发病率高,对畜禽健康危害大,会造成畜禽营养不良、生长发育障碍,给畜牧业带来严重的经济损失[1]。而生产上常使用抗生素治疗畜禽腹泻,可能导致耐药性、药物残留和环境污染等问题,随着“无抗”时代的到来,根据中兽医“治未病”的理论,在饲料中添加药食同源的天然植物为最佳的替抗方案[2]。

车前草(PlantagoasiaticaL.)属车前科车前属,是《中华人民共和国药典》收录的常用中药,在我国黑龙江、河北、江苏、广西和海南等大部分地区广泛分布,该药价格低廉,具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤和抗腹泻等生物学功能[3]。《中华人民共和国药典》记载了车前草具有良好的抗腹泻作用。研究发现,车前草可以有效缓解蓖麻油诱导的小鼠腹泻[1],其多糖有抗仔猪腹泻效应[4],生产上在牛日粮中添加车前草干粉可以治疗胃肠疾病[3]。然而,目前关于车前草防治畜禽腹泻有效活性成分及其作用机制的系统研究鲜有。因此,本试验通过网络药理学和分子对接技术分析车前草防治畜禽腹泻的有效活性成分及潜在作用机制,以期为生产上更有效利用车前草及进一步机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 车前草有效活性成分和靶点的筛选 通过传统中药系统药理学分析平台(The traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)查询“车前草”,设置口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥ 30%、类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18 筛选车前草有效活性成分和靶点,同时通过蛋白质信息数据库Uniprot(http：//www.uniprot.org/)进行蛋白名称的标准化转化,之后将车前草、车前草有效活性成分和靶点导入Cytoscape 3.7.1软件构建车前草-活性成分-靶点网络。

1.2 腹泻靶点和交集靶点的获取 在GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)和在线人类孟德尔遗传数据库(Online medelian inheritance in man,OMIM)(https：//www.omim.org/)查询“diarrhea”,搜集腹泻相关靶点合并去重,绘制韦恩图,提取药物与疾病交集靶点作为车前草治疗畜禽腹泻的潜在作用靶点。

1.3 蛋白相互作用网络的构建和关键靶点的获取 为明确各靶点间的相互作用,将1.1获得的车前草有效活性成分和1.2获得的药物和腹泻疾病交集的靶点导入STRING数据库(http：//string-db.org/),选择置信度≥0.700(high),构建蛋白质相互作用网络(Protein-protein interaction network,PPI),将产生的TSV格式文件导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析,利用其“Network Analyzer”功能分析网络拓扑特征,得到PPI。

1.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 将车前草作用于腹泻的靶点通过注释、可视化和综合发现数据库(The database for annotation,visualization and integrated discovery,DAVID)(http：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp)进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,通过设置P<0.05筛选GO条目和KEGG通路,并通过微生信在线平台(www.bioinformatics.com.cn)对结果进行可视化处理。

1.5 活性成分和关键靶点的分子对接验证 在TCMSP数据库下载车前草有效活性成分结构,在蛋白质结构数据库(Protein data bank,PDB)(http：//www.rcsb.org/)下载关键靶点的蛋白结构,以PDB格式保存。经过Autodock Vina软件对蛋白进行脱水、加氢键等处理后,进行分子对接。

2 结 果

2.1 车前草有效活性成分和靶点的筛选 基于TCMSP数据库得到车前草的10个有效活性成分,去除无靶点的成分,最终获得7个有效活性成分,分别为木犀草素(Luteolin)、黄芩素(Baicalein)、高车前素(Dinatin)、6-羟基木犀草素(6-hydroxyluteolin)、谷甾醇(Sitosterol)、黄芩苷(Baicalin)和豆甾醇(Stigmasterol),合并去重共获得113个靶点。通过Cytoscape 3.7.1软件构建车前草-活性成分-靶点网络,结果见图1,网络中共涉及121个节点(1个中药、7个活性成分和113个药物作用靶点)和159条连线。以节点的度值代表与节点连接的连线的数目,将其大小作为相互作用的衡量标准,这7个活性成分的度值分别为木犀草素57、黄芩素37、豆甾醇31、高车前素17、6-羟基木犀草素6、谷甾醇3、黄芩苷2。连接度值越高,说明该成分的作用靶点越多,为关键成分,结果表明,度值比较高的木犀草素、黄芩素、豆甾醇和高车前素为车前草治疗腹泻的关键活性成分。

图1 车前草-活性成分-靶点网络图

2.2 腹泻靶点和交集靶点的获取 通过GeneCards数据库和OMIM数据库获得腹泻靶点6 073个,将车前草作用靶点与疾病靶点取交集,共获得84个交集基因(图2)。

2.3 蛋白相互作用网络的构建和关键靶点的获取 通过STRING数据库构建PPI,选择置信度≥ 0.700(high),去除游离靶点,共得到84个节点和375条边,平均节点度为8.93。将所获得的STRING数据导入Cytoscape 3.7.1绘制同心圆PPI网络图(图3),各节点表示作用靶点,其颜色越深,半径越大,说明度值越大,相互作用越强。其中,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine-protein kinase 1,AKT1)度值最大(36),位于同心圆中心,其次是肿瘤蛋白P53(Tumor protein p53,TP53)(31)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)(30)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3,CASP3)(28)、白细胞介素6(Interleukin-6,IL-6)(27)、表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)(25)、细胞G1/S期特异细胞周期蛋白D1(G1/S-specific cyclin-D1,CCND1)(22)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9,MMP9)(20)等,以上可能是车前草治疗畜禽腹泻的关键靶点。

图3 车前草核心靶点同心圆PPI网络图

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 将2.3获得的84个靶点通过DAVID数据库分析得GO功能富集条目314条,其中生物过程(Biological process,BP)154条,细胞组分(Cellular component,CC)55条,分子功能(Molecular function,MF)105条,分别取P值由小到大的前10个条目进行可视化处理(图4),可见车前草通过调控细胞凋亡、增殖和转录等过程发挥作用。筛选得到KEGG通路条目82条,取P值较小的前20个条目绘制显著性气泡图(图5),气泡颜色越红代表富集程度越高,气泡越大代表富集基因数越多,可见车前草通过调控癌症通路和磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase-serine/threonie-protein kinase,PI3K-AKT)信号通路等多种信号通路发挥作用。

图4 GO功能富集分析

2.5 活性成分和关键靶点的分子对接验证 将车前草排名前二的有效活性成分木犀草素、黄芩素与PPI排名第一的作用靶点AKT1进行分子对接分析(图6),木犀草素与AKT1对接结合能为-9.654 kJ/mol,黄芩素与AKT1对接结合能为-9.493 kJ/mol。结合能小于0表明两者可以自由结合,结合能越低,表明活性成分和关键靶点的结合越稳定。

图6 有效活性成分与关键靶点的分子对接模式图

3 讨论

本试验根据TCMSP数据库,筛选到车前草通过活性成分木犀草素、黄芩素、豆甾醇和高车前素发挥治疗腹泻的作用。以往的研究发现,这几种成分都有抗炎、免疫调节和抗菌等药理作用。木犀草素能够下调TNF和IL-6等基因表达来保护肠黏膜屏障[5-6],不仅能减轻试验小鼠的结肠炎症状,还能上调肌酸激酶活性以增加钠离子和钾离子浓度,减少肠内容物体积和重量,发挥抗腹泻作用[7]。黄芩素能抑制小鼠结肠炎,还可通过提高凋亡蛋白浓度导致癌细胞发生自噬,或通过PI3K-AKT信号通路诱导细胞自噬来发挥抗癌作用[8-9]。豆甾醇属于类固醇,类似于甾体类激素,可以降低仔猪腹泻率[10]。高车前素具有较好的治疗腹泻的作用,能显著减少蓖麻油诱导小鼠腹泻模型的腹泻次数[11-12]。综上,车前草的多种活性成分都具有治疗畜禽腹泻的作用。

通过构建车前草有效活性成分和腹泻交集靶点的PPI图分析筛选出度值大的靶点,即为车前草治疗腹泻的关键靶点,其中,AKT1可参与体内葡萄糖的吸收转运,调控细胞自噬和凋亡等生物过程,其被PI3K磷酸化后能调控促炎因子TNF和IL-6的释放[13],促炎因子可上调MMP9基因表达量[14],参与机体炎症反应,通过调控肠道稳态和肠细胞自噬过程调节肠道炎症和胃癌等疾病的发生发展[15-16]。而CCND1、EGFR、TP53和CASP3共同参与调节细胞生长、增殖和凋亡等过程。EGFR与细胞外调节蛋白激酶通路(Extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK 1/2),诱导与细胞周期和增殖相关基因表达,同时能刺激DNA结合蛋白酶反应,导致炎症反应,影响肠屏障,最终引起腹泻[17-18]。CCND1和TP53在细胞周期调控中起重要作用,炎症可诱导TP53突变,使其过度表达引起细胞异常增殖,导致胃癌和肠癌等多种癌症的发生[19-20]。CASP3是半胱氨酸蛋白酶家族中的重要成员,为细胞凋亡过程关键酶,是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,可诱导细胞发生凋亡,还与癌症发生相关[21]。由此推测,车前草主要通过以上关键靶点通过调控炎症发生和细胞生长共同发挥止泻作用。

GO功能富集结果显示,车前草可能通过对药物的反应、对异生外刺激的反应、调节细胞凋亡和转录过程、对细胞增殖的积极调节等来治疗腹泻。KEGG通路富集分析结果显示,车前草作用于腹泻的关键靶点主要富集于：(1)与疾病有关的信号通路：癌症、脂质和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙型肝炎等,提示其关键靶点与多种癌症通路相关,腹泻是胃癌和肠癌等多种癌症的临床表现之一,同时胃肠炎症也会诱导肿瘤的发生[22];(2)与细胞生物过程相关的信号通路：PI3K-Akt 信号通路和缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信号通路等。PI3K-Akt信号通路能调控细胞凋亡和细胞自噬等多种生物过程,该通路被激活后能磷酸化凋亡蛋白Bax,使其丧失活性,同时P13K/Akt还是肿瘤细胞重要的信号通路,参与调节胃癌和肠癌等肿瘤发生发展过程,通过调控细胞因子的释放在肠道炎症反应中发挥重要作用[23-24]。HIF-1是一种缺氧信号通路,参与细胞外基质形成和血管新生,可以调节肠道功能和保护肠道屏障,还与炎症性肠病的发生相关[25]。因此,车前草可能通过以上通路保护胃肠道屏障,减少炎症反应,调控细胞自噬和凋亡过程以发挥抗腹泻作用。然而,脂质和动脉粥样硬化等部分疾病通路是否与腹泻相关,还需要进一步验证。

活性成分和关键靶点的分子对接结果显示,车前草的有效活性成分木犀草素和黄芩素,与关键靶点AKT1的结合能均小于0 kJ/mol,初步证实车前草有效活性成分与关键靶点可稳定结合,且结合力良好,提示木犀草素和黄芩素通过作用于AKT1从而发挥止泻功能。

综上所述,本试验通过网络药理学方法获得车前草主要活性成分为木犀草素、黄芩素、豆甾醇和高车前素等,活性成分作用于AKT1、TP53、TNF、CASPS和IL-6等靶点,通过干预癌症、PI3K-Akt 信号通路和HIF-1信号通路在机体发挥抗腹泻作用,这为阐明车前草的药理活性及其防治畜禽腹泻的作用机制提供理论支撑,为进一步挖掘车前草的功能和拓宽其应用提供研究思路。