动物源产气荚膜梭菌致病因子和耐药性研究进展

吴 克,王 娟,杨增岐

(西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨陵 712100)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens,C.perfringens)是杆菌科、梭菌属的一种革兰阳性厌氧菌,最初于1891年从腐败尸体中分离,命名为产气荚膜杆菌(Bacillusaerogenescapsulatus)[1-2]。C.perfringens广泛存在于人和动物肠道以及植被、河流和土壤等多种自然环境中,是一种常见的条件性致病菌[3],因能够造成多种人畜疾病而被广泛关注。近年来,由于抗生素在畜牧养殖中的大量应用,动物源C.perfringens耐药性逐渐增强。

1 产气荚膜梭菌致病因子

C.perfringens能够引起气性坏疽、食物中毒和坏死性肠炎等多种疾病 ; 在英国、韩国和美国等国家,C.perfringens是引起人类食源性疾病的主要因素,对公共卫生安全具有较大威胁。研究显示,C.perfringens的致病性主要取决于其产生的蛋白毒素(表1),此外芽胞和生物被膜也在C.perfringens的传播和致病中发挥重要作用[4]。

表1 产气荚膜梭菌部分毒素编码基因及分子量大小

1.1 产气荚膜梭菌毒素 正常条件下,C.perfringens可在肠道生存但难以导致机体发病,当外界环境突变、饮食结构改变或抗生素治疗不当导致肠道稳态遭到破坏时,C.perfringens可快速增殖并产生大量蛋白毒素入侵机体。目前已知C.perfringens可产生20余种毒素和酶,根据对其中6种毒素[α毒素(Alpha toxin,CPA)、β毒素(Beta toxin,CPB)、ɛ毒素(Epsilon toxin,ETX)、毒素(Iota toxin,ITX)、产气荚膜梭菌肠毒素(C.perfringensenterotoxin,CPE)和坏死性肠炎B样毒素(Necrotic enteritis toxin B-like toxin,NetB)]的产生能力,C.perfringens被分为A～G 七个毒素型[5],除参与分型的毒素外,θ毒素(Perfringolysin O,PFO)、β2毒素(CPB2)和唾液酸酶(NanH和NanI)等其他毒素和酶也在C.perfringens入侵机体过程中发挥重要作用。

1.1.1 α毒素 CPA是最常见的C.perfringens毒素,有溶血性,所有毒素型C.perfringens菌株均可产生,但通常情况下A型C.perfringens产生CPA的能力较强[6]。CPA是由位于C.perfringens染色体上的高度保守性序列cpa(plc)编码、由370个氨基酸构成的分子量为43 kDa的毒素蛋白,具有N端(N-terminal domain,NTD,1～250位氨基酸)和C端(Carboxy-terminal domain,CTD,251～370位氨基酸)两个结构域[7]。CPA的CTD和NTD具有不同的生物活性,其中NTD具有磷脂酶C和鞘磷脂酶活性,CTD能引起机体的免疫反应;研究显示,CPA的CTD能够引起与完整蛋白毒素相同的免疫效果,目前针对CPA的重组疫苗也主要是通过表达其CTD来制备[8]。CPA在机体的外伤感染和气性坏疽的形成和发展中发挥重要作用,C.perfringens在机体增殖产生CPA,溶解细胞膜磷脂成分从而导致细胞坏死;此外,CPA还能够通过影响免疫细胞转移、收缩血管和激活免疫级联反应加剧感染[9]。

1.1.2 β毒素 CPB是由B型和C型C.perfringens产生的一种由位于质粒上的毒素基因cpb编码的分子量为35 kDa的穿孔毒素,对巯基试剂和蛋白酶高度敏感[10]。毒素基因cpb在B型和C型C.perfringens中均位于pCW3样质粒上,但cpb在B型C.perfringens中仅位于65 kb或90 kb质粒,在C型C.perfringens则位于介于65～110 kb多种大小的质粒[11]。CPB单体具有水溶性,其与机体靶细胞表面受体结合后能够插入细胞膜形成穿孔复合体导致细胞膜穿孔;该毒素通常可破坏肠上皮细胞,造成仔畜的出血性肠炎和肠毒血症,伴随有出血性腹泻、胀气和呕吐;当其被吸收进入机体循环系统后能够作用于神经系统,引起机体动脉收缩和血压升高等症状[12]。

1.1.3 ɛ毒素 ETX是由B型和D型C.perfringens中pCW3样质粒上的毒素基因etx编码产生的分子量大小为33 kDa的穿孔毒素[13]。ETX是D型C.perfringens引起机体发病的关键毒素,也是绵羊和山羊肠毒血症的主要致病因子。该毒素刚产生时毒力较弱,可通过肠道中多种蛋白酶加工去除N端和C端残基或通过菌体产生的λ蛋白酶切除N端10个氨基酸的方式进行激活。活化后的ETX毒性极强,可作用于肾脏、肺脏和脑等多种器官,半数致死量达到70 ng/kg,是一种仅次于肉毒毒素和破伤风毒素的细菌毒素[14]。该毒素可嵌入细胞膜形成穿孔,造成血管通透性增强和肠道上皮细胞破裂,导致机体出现肠炎和腹泻;此外,ETX还可造成脑组织中血管周围星形胶质细胞肿胀破裂,导致血管周围水肿、颅内压升高和脑组织局部软化[15]。

1.1.5 产气荚膜梭菌肠毒素 CPE是由F型、B型、C型和D型C.perfringens产生的穿孔毒素,该毒素是由染色体或质粒上的毒素基因cpe编码的分子量大小为35 kDa的单肽,由CTD和NTD两个结构域组成。约70%的cpe基因位于染色体,其余位于pCW3样质粒上[18]。CPE能够破坏肠上皮细胞之间的紧密连接,尤其对结肠和回肠上皮细胞的毒性作用较强,可导致以腹泻和腹部绞痛为主要特征的人类食物中毒和非食源性胃肠道疾病[19]。

1.1.6 坏死性肠炎B样毒素 NetB由G型C.perfringens产生,是一种由位于pCW3样质粒的毒素基因netB编码的穿孔毒素,分子量大小为33 kDa[20]。与CPB和ETX相同,该毒素可在细胞质膜上形成穿孔,导致细胞出现变形裂解;NetB可作用于机体包括肠道在内的多种器官,主要导致的疾病为禽类坏死性肠炎[21]。

1.1.7 其他毒素 除参与分型的毒素外,C.perfringens产生的其他毒素也具有直接致病或协同致病作用。其中,CPB2是由位于pCW3/pCP13样质粒上的毒素基因cpb2编码的一种穿孔毒素,分子量为28 kDa,具有一定的细胞毒性且与仔猪腹泻密切相关;PFO由染色体上的毒素基因pfoA编码,分子量为54 kDa,具有穿孔毒素和溶细胞素活性,是C.perfringens引起气性坏疽的关键毒力因子;TpeL毒素是由pCW3样质粒上毒素基因tpeL编码的一种大型梭状芽胞杆菌细胞毒素,分子量为206 kDa,能够造成细胞膜穿孔,在G型C.perfringens引起家禽坏死性肠炎中发挥作用[22];NanH和NanI分别由染色体上的毒素基因nanH和nanI编码,分子量分别为43 kDa和77 kDa,均具有神经氨酸酶活性,并可协同CPE入侵机体细胞[23-24]。产气荚膜梭菌部分毒素编码基因及分子量大小见表1。

1.2 芽胞和生物被膜 除毒素外,芽胞和生物被膜在C.perfringens的传播致病中也发挥重要作用。芽胞是C.perfringens的一种高抗性存在形式,也是C.perfringens被当作重要食源性致病菌的关键因素之一。当外界环境不适宜生存繁殖时,C.perfringens繁殖体通过质膜的不均等分裂产生大小不同的两个菌体,经系列反应后,大菌体裂解,较小菌体最终形成芽胞[25]。形成芽胞的C.perfringens对温度、渗透压、化学防腐剂和pH等多种环境因素的抵抗力显著增强;研究显示,在55～100 ℃的高温环境、-20～4 ℃的低温环境、双氧水等消毒剂处理情况下,C.perfringens芽胞的存活时间和数量均显著高于繁殖体;并且当外界环境适宜时,C.perfringens芽胞在20 min内即可恢复正常生长繁殖[26]。C.perfringens芽胞可在水和土壤等自然环境中长期存在,在食品加工过程中C.perfringens芽孢难以被有效杀灭,被食入后可通过在人类肠道中产生CPE导致腹泻和呕吐等多种症状[27]。除引起食源性感染,外界环境的C.perfringens芽胞与人或动物的创口接触后,能够快速转变为繁殖体并产生CPA和PFO等毒素导致气性坏疽,严重者可导致死亡[28]。

与芽胞相似,生物被膜是细菌抵抗外界环境压力的一种存在形式,生物被膜由细胞和包裹细胞的胞外聚合物组成,胞外聚合物的主要成分是DNA、多糖和蛋白质[29]。相比于浮游状态的细菌,生物被膜能够增强细菌对外界环境的抵抗力,并且由于形成生物被膜的细菌处于休眠状态,对外界物质的摄取能力降低,其对抗生素的敏感性也降低。研究显示,C.perfringens具有较强的生物膜形成能力,且形成生物膜的C.perfringens对青霉素、泰乐菌素、杆菌肽和莫能菌素等抗生素,以及次氯酸钠和过氧化氢的抵抗力也显著增强[4,30]。

1.3 产气荚膜梭菌质粒C.perfringens对肠道具有强致病性的毒素编码基因几乎都位于质粒上,C.perfringens菌株对质粒的携带情况很大程度上影响其对人和动物的肠道致病能力。目前研究显示,C.perfringens基因组中共存在3种质粒类型,分别为pCW3样质粒、pCP13样质粒和pIP404样质粒,其中pCW3样质粒和pCP13样质粒可接合转移[31]。pCP13样质粒大小为54 kb,能够携带毒素基因cpb2和bec[32];pIP404样质粒是C.perfringens中一种不可转接的小质粒,常携带细菌素编码基因bcn[33]。pCP13样质粒和pIP404样质粒的多样性和研究程度均远低于pCW3样质粒,pCW3样质粒是C.perfringens中最常见且研究最多的质粒类型,该质粒大小为47～135 kb,可在所有毒素型C.perfringens中存在,并且同一株C.perfringens中能够携带多个pCW3样质粒。pCW3样质粒的接合转移主要依靠其tcp区域,该区域能够编码TcpA～TcpK和TcpM共十二种蛋白,其中TcpA、TcpD、TcpE、TcpF和TcpH在pCW3接合转移中至关重要[31]。除携带有影响其接合转移的tcp区域外,pCW3样质粒中还能够携带插入序列、转座酶基因和四环素耐药基因,以及cpb、etx、iap/ibp和netB等多种毒素基因[34]。

2 产气荚膜梭菌耐药性

随着畜牧业的快速发展,抗生素被大量应用于畜牧生产,造成了动物源细菌耐药性的增强和多种耐药基因的传播。1968年首次报道C.perfringens对四环素耐药[35];1978年便有报道指出,C.perfringens出现对四环素、红霉素、克林霉素和林可霉素耐药的多重耐药菌株[36],随后在C.perfringens中陆续发现tet(A)、lnu(P)、erm(A)和erm(Q)等多种耐药基因[37]。

2.1 动物源产气荚膜梭菌耐药性 近5年,我国动物源C.perfringens耐药性的报道显示,不同来源C.perfringens菌株的耐药性存在一定差异,且对人用抗生素的耐药性有增强趋势。华中地区肉鸡[38]、辽宁省鸡[39]、山东省鸭[40]、北京市和山西省猪、鸡[41]和甘肃省绵羊[42]的C.perfringens耐药性研究结果显示,分离菌株普遍对磺胺类药物严重耐药,对四环素类抗生素、林可酰胺类抗生素和氨基糖苷类抗生素中等程度耐药,且分离菌株可检测出tetA(P)、aac(6′)-aph(2″)、ant(6)-Ib、erm(Q)、tet(44)、erm(A)和erm(B)等多种耐药基因[41-42]。此外,猪源C.perfringens对所测试抗生素的耐药性显著强于鸡、鸭和羊源C.perfringens。除畜牧生产常用抗生素外,我国于2020年首次发现,鸡源C.perfringens分离菌株对人医临床抗生素利奈唑胺具有耐药性,且携带有噁唑烷酮类耐药基因optrA[43];并且2021年于藏羊源C.perfringens中也检测到optrA[42],表明其在我国C.perfringens菌株中存在一定程度的传播。世界其他国家,如美国[44]、约旦[45]、埃及[46]、印度[47]、加拿大[48]和泰国[49]关于C.perfringens耐药性的报道显示,分离菌株对磺胺类药物、四环素、链霉素、林可霉素和红霉素等药物耐药性较强,对青霉素、氨苄西林、阿莫西林和头孢菌素类抗生素耐药性较弱。

综上所述,C.perfringens耐药性随菌株的来源不同而存在一定差异,但整体耐药趋势一致;表现为对磺胺类药物、庆大霉素、红霉素和链霉素等药物耐药性严重;对四环素、林可霉素和克林霉素等药物的耐药性中等;对青霉素、氨苄西林、万古霉素和头孢菌素类抗生素耐药性较弱。

2.2 产气荚膜梭菌耐药基因流行趋势 对2022年4月前上传至GenBank数据库的476份C.perfringens二代测序基因组数据进行耐药基因检测,结果显示,476株C.perfringens中共检测出22种耐药基因,其中四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的检出率显著高于其他耐药基因(P<0.05),分别为64.71%和32.98%;林可酰胺类耐药基因erm(Q) 和lnu(P)、氨基糖苷类耐药基因aac(6′)-aph(2″)以及四环素类耐药基因tet(44)的检出率也较高(4%～10%)。除上述耐药基因外,少数C.perfringens还携带噁唑烷酮类耐药基因optrA,多重耐药基因cfr(c),碳青霉烯类耐药基因blaTEM-116、blaTEM-171和blaTEM-229等(表2)。四环素类耐药基因、氨基糖苷类耐药基因和林可酰胺类耐药基因的高携带率在一定程度上解释了世界范围C.perfringens菌株对四环素和克林霉素等药物的耐药性;但所有的C.perfringens菌株中均未检测到磺胺类药物耐药基因,与多地报道的C.perfringens对磺胺类药物高度耐药不符,推测C.perfringens可能对磺胺类药物天然耐药。

表2 产气荚膜梭菌耐药基因流行情况

2 小结

综上所述,C.perfringens是一种严重危害人畜健康的条件致病菌,可通过芽胞和生物被膜在多种环境中生存和传播,并且可产生多种毒素导致人畜患病。近年来,由于抗生素在畜牧养殖中的大规模应用,动物源C.perfringens耐药性逐渐增强,其不仅对多种兽用抗生素耐药性严重,而且对某些人医临床抗生素也产生了一定耐药性。作为一种重要的人兽共患致病菌,动物源C.perfringens耐药性的增强无疑会对公共卫生安全造成严重威胁。为降低其危害,应加强对环境和食品中C.perfringens的消杀以防止其传播致病,并规范畜牧养殖中抗生素的使用,防止C.perfringens耐药性的进一步增强。