动物园动物消化道寄生虫感染情况调查

安迪娅,陈宜军,裴艳群,祝子伏,冯子轩,王丽芳,刘 群,3,贾 婷,张昌盛,刘 晶,3

(1. 中国农业大学动物医学院国家动物寄生原虫实验室,北京 海淀 100193 ; 2. 北京市畜牧总站,北京 朝阳 100101 ;3. 中国农业大学动物医学院农业农村部动物流行病学重点实验室,北京 海淀 100193 ; 4.北京动物园 ,北京 西城100044 ; 5.国家自然博物馆,北京 东城 100050)

寄生虫病是野生动物的常见疾病,严重危害野生动物健康。处于高饲养密度条件下的动物园动物,更容易造成寄生虫病在种群间的传播[1]。与此同时,动物园游人和动物的接触机会较多,更容易造成人兽共患寄生虫病在人类和动物之间的传播和流行。动物园动物的健康不仅是动物园的保护和管理目标,也关系着全体人类的健康。本试验通过对贵阳和北京动物园动物的肠道寄生虫感染情况进行调查和分析,了解感染寄生虫的种类和感染率,为动物园制定驱虫方案提供参考,同时也为人兽共患寄生虫病的防控提供可借鉴的背景资料。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2021年7—11月,从贵阳野生动物园和北京动物园采集了33种动物的共150份新鲜粪便样品(灵长类44份,禽类2份,食肉类26份,偶蹄类61份,奇蹄类11份,有袋类1份,长鼻类5份),其中贵阳49份,北京101份。将采集的动物粪便装入洁净的自封袋内,记录下采样时间、地点和动物种类等,置于4 ℃冰箱内保存。将采集的动物粪便样品一式3份,1份用于寄生虫的显微镜检查,1份经3次水洗后用于粪便DNA的提取,1份置于2.5%重铬酸钾中用于粪便样品的保存。

1.2 主要试剂 饱和食盐水和2.5%重铬酸钾溶液,均为本实验室自制;粪便DNA提取试剂盒,购自天根生化科技有限公司;Goldview 核酸染料,购自北京索莱宝科技有限公司;2×TaqPlus Master Mix,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;DL2 000 Plus Marker,购自北京聚合美生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 显微镜检查 粪便样品经饱和盐水漂浮法和离心沉淀法处理,在光学显微镜下检查,根据寄生虫虫体、虫卵和卵囊的形态、大小和颜色等,参考畜禽寄生虫分类图鉴[2]对所观察到的寄生虫进行初步鉴定。

1.3.2 PCR扩增 按照粪便DNA提取试剂盒说明书操作提取粪便样品DNA,通过PCR扩增隐孢子虫的核糖体小亚基RNA(Small subunit ribosome RNA,SSU rRNA)基因[3]、毕氏肠微孢子虫内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)基因[4]、芽囊原虫SSU rRNA基因[5]、十二指肠贾第虫磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase,tpi)基因和β-贾第素(β-giardin,bg)基因[6],对肠道原虫种类进行鉴定,除对芽囊原虫进行1 轮PCR扩增外,其余肠道原虫均进行2 轮的巢式PCR扩增。所用引物由北京睿博兴科公司合成。取芽囊原虫普通PCR扩增产物以及隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和十二指肠贾第虫巢氏的第2轮PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果通过凝胶成像分析系统进行观察并拍照记录,将阳性PCR扩增产物切胶送至北京睿博兴科公司进行序列测定。

1.4 序列比对 将测序所得序列进行校正,将校正后的序列在 GenBank 上用 Blast 进行同源序列的搜索,应用Clustal X 2.13软件结合下载的参考序列进行比对分析,判断肠道原虫的虫种或基因型。

1.5 统计学分析 使用SPSS 22.0对所得数据进行卡方检验,P>0.05为统计学差异不显著,0.01

2 结果

2.1 动物园动物肠道寄生虫感染情况 如表1所示,通过显微镜检查和PCR检测,本试验检测的150份样品中,肠道寄生虫的总感染率为64.0%(96/150),其中贵阳野生动物园寄生虫感染率为77.6%(38/49),北京动物园感染率为57.4%(58/101),2个动物园寄生虫感染率差异显著(P<0.05)。

表1 动物园动物肠道寄生虫感染情况

2.2 粪便中寄生虫的形态学鉴定 如表1所示,通过显微镜检查,观察到的寄生虫虫卵或卵囊包括4类：毛首线虫、细颈线虫、艾美耳球虫和其他线虫(部分虫卵或卵囊如图1所示)。其中,毛首线虫感染率为20.0%(30/150)、细颈线虫感染率为2.7%(4/150)、艾美耳球虫感染率为14.7%(22/150)、其他线虫感染率为25.3%(38/150)。共在4种动物类群中检测到寄生虫,其中偶蹄类动物寄生虫感染率最高,为78.7%(48/61),共检出4类寄生虫：毛首线虫32.8%(20/61)、艾美耳球虫32.8%(20/61)、细颈线虫6.6%(4/61)、其他线虫50.8%(31/61);灵长类动物寄生虫感染率为25.0%(11/44),其中毛首线虫感染率最高,为22.7%(10/44);长鼻类动物寄生虫感染率为60.0%(3/5),均为其他线虫的感染;禽类寄生虫感染率为50.0%(1/2);食肉类、奇蹄类和有袋类动物的样品中没有检测到寄生虫虫卵。

图1 显微镜检出的部分寄生虫虫卵或卵囊

2.3 4种肠道原虫的PCR扩增

2.3.1 隐孢子虫感染情况和虫种鉴定 基于隐孢子虫SSU rRNA基因,共检出2份PCR阳性样品,总感染率为1.3%(2/150)。其中,贵阳野生动物园感染率为2.0%(1/49),北京动物园感染率为1.0%(1/101)。2份PCR阳性样品经测序比对分析,鉴定为2种隐孢子虫：安氏隐孢子虫(C.andersoni)和泛在隐孢子虫(C.ubiquitum),分别来自骆驼(n=1)和盘羊(n=1)。部分样品隐孢子虫PCR扩增结果见图2A。

图2 4种肠道原虫的PCR扩增

2.3.2 毕氏肠微孢子虫感染情况和基因型鉴定 基于毕氏肠微孢子虫ITS基因,共检出13份PCR阳性样品,总感染率为8.7%(13/150)。其中,贵阳野生动物园感染率为12.2%(6/49),北京动物园感染率为6.9%(7/101)。13份PCR阳性样品经过序列比对分析,共鉴定出7种基因型：SC02(n=1)、BEB6(n=3)、Type IV(n=2)、PigEBITS7(n=2)、Peru8(n=1)、PtEBIX(n=3)和D(n=1)。不同动物中的基因型分布情况见表2。部分样品毕氏肠微孢子虫PCR扩增结果见图2B。

表2 不同动物中毕氏肠微孢子虫的基因型分布

2.3.3 十二指肠贾第虫感染情况和基因型鉴定 基于十二指肠贾第虫tpi和bg基因,共检出18份PCR阳性样品,总感染率为12.0%(18/150)。其中,贵阳野生动物园感染率为16.3%(8/49),北京动物园感染率为9.9%(10/101)。18份PCR阳性样品经过序列比对分析,共鉴定出E和B 两种基因型,其中9份样品为集聚体E的单纯感染：长颈鹿(n=2)、奶山羊(n=1)、环尾狐猴(n=1)、北山羊(n=2)、盘羊(n=1)和狍子(n=2);7份样品为集聚体B的单纯感染：黑猩猩(n=1)和环尾狐猴(n=6);2份样品为集聚体E和B的混合感染：奶山羊(n=1)和棕熊(n=1)。不同动物园十二指肠贾第虫的检出情况见表3。部分样品十二指肠贾第虫PCR扩增结果见图2C和图2D。

表3 不同动物园中十二指肠贾第虫的集聚体类型分布

2.3.4 芽囊原虫感染情况和基因亚型鉴定 基于芽囊原虫SSU rRNA基因,共检出48份PCR阳性样品,总感染率为32.0%(48/150)。其中,贵阳野生动物园感染率为24.5%(12/49),北京动物园感染率为35.6%(36/101)。共在5种动物类群19种动物中检测到芽囊原虫的感染,其中偶蹄类动物的感染率为47.5%(29/61)、灵长类为36.4%(16/44)、禽类为50.0%(1/2)、长鼻类为20.0%(1/5)、食肉类为3.8%(1/26)。对48份PCR阳性样品进行测序比对分析,共鉴定出8种基因亚型：ST1(n=11)、ST2(n=3)、ST3(n=1)、ST5(n=8)、ST8(n=2)、ST10(n=11)、ST13(n=2)和ST14(n=10)。不同动物中芽囊原虫基因亚型的分布情况见表4。部分样品芽囊原虫PCR扩增结果见图2E。

表4 不同动物中芽囊原虫的基因亚型分布

2.4 寄生虫的混合感染情况 本试验检测的150份样品中,共有51份样品为2种及2种以上的肠道寄生虫的混合感染,混合感染率为34.0%(51/150)。其中,贵阳野生动物园寄生虫混合感染率为46.9%(23/49),北京动物园为27.7%(28/101)。2种寄生虫混合感染率为20.0%(30/150),主要为芽囊原虫和毛首线虫;3种寄生虫混合感染率为10.0%(15/150);4种寄生虫混合感染率为4.0%(6/150)。

3 讨论

在本次调查中,动物园动物寄生虫的感染率较高,混合感染以线虫和芽囊原虫为主,其中贵阳野生动物园的寄生虫感染率(77.6%,38/49)比北京动物园(57.4%,58/101)高,这可能与贵阳野生动物园的地理位置及其饲养管理有关。贵阳野生动物园所处地理位置属于亚热带湿润季风气候,常年雨量充沛,气候温和,有利于寄生虫的生长和发育。除此之外,贵阳野生动物园内的动物多为散养或混养,动物的活动范围广,不同种群间的动物接触增加,更有利于寄生虫的传播。

本试验通过显微镜检查发现,动物园动物的线虫感染率比较高,这可能是由于动物的活动区域多为泥土的场地,线虫多为土源性寄生虫,而且土源性线虫的发育不需要中间宿主,其虫卵或幼虫可以在外界发育至感染期后直接感染宿主有关。在所调查的7种动物类群中,同为草食动物的偶蹄类动物和长鼻类动物的寄生虫感染率较高,且多为线虫的感染,与文献报道的广州和贵阳动物园草食动物的寄生虫感染情况相似[7-8];灵长类动物的毛首线虫感染率较高,与陈小丽[9]和李波[10]对我国部分动物园灵长类动物消化道寄生虫的调查结果一致。

本试验通过PCR检测发现,隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫、十二指肠贾第虫和芽囊原虫4种寄生虫中芽囊原虫的感染率最高。本试验共鉴定出了2种隐孢子虫虫种：从盘羊中检出的泛在隐孢子虫和骆驼中检出的安氏隐孢子虫,分别是我国羊和骆驼隐孢子虫感染的主要虫种。虽然在国外有关于骆驼感染小鼠隐孢子虫的报道[11],但在我国,尚未有骆驼感染除安氏隐孢子虫外的其他隐孢子虫种的报道。本试验鉴定出的十二指肠贾第虫包括2种集聚体类型(B和E),其中集聚体B能够感染人类和多种动物,集聚体E多在偶蹄类动物中检出[12]。本试验从环尾狐猴和黑猩猩中检测出了集聚体B,在长颈鹿、奶山羊和北山羊等偶蹄类动物中检测到了集聚体E,进一步证实了之前的报道。本试验在毕氏肠微孢子虫的检测中共鉴定出7种基因型,其中SC02、Type IV、PigEBITS7、Peru8和D均为人兽共患基因型,SC02是毕氏肠微孢子虫感染大熊猫的优势基因型[13],在灰狼中检测到的PtEb IX是犬科动物中常见的毕氏肠微孢子虫基因型[10]。本试验共发现8种芽囊原虫的基因亚型,其中ST1和ST2主要分布在非灵长类动物中,ST5、ST10和ST14主要存在于有蹄类动物中,这与之前的报道一致[14]。本试验在多种动物中检测到了人兽共患寄生虫虫种和基因型,提示饲养员和游客应该注意与动物的接触方式,防止感染人兽共患寄生虫病。

动物园动物饲养密度较大,更容易造成寄生虫病的流行。动物园内工作人员应做好动物园内各个圈舍的卫生消毒,对动物的粪便及时进行清理。根据寄生虫病的流行规律,选择合适的驱虫药物对动物园实施春秋2次预防性驱虫。每个动物园需要制定符合实际需求的寄生虫病防治策略,针对不同的动物、不同种类寄生虫的流行规律,采取“预防为主,防治结合”的原则实施防治措施,防止寄生虫在动物种群内以及动物与人类之间的传播。