磁性多壁碳纳米管—微生物联合修复石油污染土壤

李志文，许湘湘，刘帅，杨妮楠，曹迪

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

石油是全球主要能源，在民生和国防科技等方面都起着重要的支撑作用。由于石油开采、运输过程中存在技术不成熟、操作不当等问题，因此造成石油资源浪费的现象，同时还导致严重的石油污染问题[1-2]。石油烃成分复杂，有挥发性，含碳量高，不易降解，能够在环境中持续稳定存在，一旦石油流入土壤中，对农作物、植物、人类乃至整个土壤生态系统都会产生恶劣的影响[3]。当石油烃物质流入到土壤后，会改变土壤的理化性质和持水性[4]、对土壤中的微生物代谢活动产生影响并破坏土壤中的微生物群落结构[5]。除此之外，石油烃的渗入会使土壤的渗透性降低，进而抑制粘附在植物根系的根系呼吸与吸收，最后导致植物根系腐烂[6]。随着工业化技术的不断发展，人类对石油的需求日益增加，石油污染问题也随之愈演愈烈，特别是针对于土壤的污染问题，因此急需探究更为有效的方法解决石油土壤污染问题。

目前，石油污染土壤的修复技术主要有物理、化学和微生物修复技术，其中微生物修复技术由于不会造成二次污染而被广泛研究[7]。但是当一些功能性石油降解微生物投放到石油污染土壤中可能会受到土壤环境与土著微生物的影响致使降解率降低，物理吸附法中的一种载体即多壁碳纳米管的应用则可以辅助石油降解微生物更好修复石油污染土壤。多壁碳纳米管吸附性强，化学结构稳定，对重金属离子和有机污染物方面都呈现出优良的吸附效果。多壁碳纳米管的吸附性能主要受到吸附位点、比表面积、表面功能团、纯度、孔隙度等结构特征的影响。且多壁碳纳米管的表面结构具有化学惰性的特点，这一特点恰好使其具备了明确的吸附位点，具有更强的吸附能力和更广泛的吸附范围[8-9]。磁处理与吸附剂相结合是近几年的热点。魏栖梧等[10]制备出的磁性多壁碳纳米管有效引入了含氧官能团（-COOH）及磁性Fe-O 基团，对水溶液中Cu（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）及Pb（Ⅱ）呈现出良好的吸附分离效果。赵伟高[11]通过液相化学沉积法制备的磁性多壁碳纳米管具有超顺磁性和良好的磁分离特性，在四环素（TC）和铜离子的吸附研究中保持了良好的吸附性能。磁性多壁碳纳米管在对染料的吸附研究中也表现出来明显的吸附性能[12-13]。

基于以上研究，选用两种不同的磁性氧化晶体Fe3O4和MnFe2O4对多壁碳纳米管进行磁化处理并与已筛选得到的高效石油降解菌联合修复石油污染土壤。对制备的磁性多壁碳纳米管进行关于SEM、FTIR、Zeta、XPS 的表面特征分析，测定不同的磁性多壁碳纳米管和高效石油降解菌的组合下对石油污染土壤的降解率，同时测定了土壤的含水量、铵态氮和有效磷的变化。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试菌株：石油降解菌LD23（假单胞菌Pseudomonas）（降解率为47.72%）、NYJ3.6（伪产碱假单胞菌 Pseudomonas pseudoalcaligenes）（降解率为43.46%）均为已保藏菌株，目前保藏于中科院微生物菌种保藏所，保藏号分别为CGMCC No.1679、CGMCC No.17570。

无机盐原油培养基：KH2PO43.0 g，Na2HPO4·2H2O 8.5 g，NH4Cl 1.0 g，Mg2SO4·7H2O 0.49 g，CaCl20.011 g，NaCl 10 g，液体石蜡2%（V/W），pH 自然，蒸馏水定容至1 L。

LB 培养基：蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，琼脂20.0 g，酵母浸粉5.0 g，pH 调节至7，蒸馏水定容至1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 两种磁性碳纳米管的制备

两种磁性碳纳米管的制备方法对比：Fe3O4/碳纳米管（CF）和MnFe2O4/碳纳米管（CM）制备方法主要是赋磁材料不同，CF 为FeCl3·6H2O 和FeCl2·H2O，CM 赋磁材料为MnCl2·4H2O 和FeCl3·6H2O，两种方法的赋磁材料摩尔质量比均为2∶1，将赋磁材料和多壁碳纳米管（CMT）于去离子水中混合均匀后放入超声振荡清洗机超声振荡30 min。在85 ℃恒温水浴锅中加入一定量5 mol·L-1的NaOH 溶液搅拌混匀后，将烧杯放入磁力搅拌器于50 ℃条件下搅拌半小时。搅拌后静置、除上清并烘干沉淀。用去离子水冲洗至上清液pH 到7，可去除Cl-、Na+等离子。将清洗后的沉淀放入烘箱并放入自封袋保存。

1.2.2 两种磁性碳纳米管的表征分析

对制备好的Fe3O4/碳纳米管和MnFe2O4/碳纳米管进行表面特征分析。利用扫描电子显微镜FEG-250 分析表面形态，Zeta 电位ASP 型电位分析仪测定表面电荷、红外光谱仪（FTIR）分析测定表面官能团、X 射线光电子能普（XPS）进行表面元素分析。

1.2.3 不同处理方式对土壤理化指标的影响

菌液的制备：所用的菌株材料准备将已纯化的菌株在其处于对数生长期时以10%的菌量制作菌悬液并接种于100 mL 的石油发酵培养基中（每株菌接6 瓶平行实验，3 瓶用于紫外分光光度法，3 瓶用于称重法），以空白石油发酵培养基作为对照，在摇床中150 rpm 培养7 d。

每个花盆均添加392 g 的土壤和8 g 的石油（配制成2%的石油浓度），再加入一定量的蒸馏水充分混合均匀后，分别添加1 g 不同的磁性碳纳米管和8mL 不同的菌液，静置7 d。四种不同处理组方法包括：LD23 菌液和Fe3O4/碳纳米管（CF）、NYJ3.6 菌液和Fe3O4/碳纳米管（CF）、LD23 菌液和MnFe2O4/碳纳米管（CM）、NYJ3.6 菌液和MnFe2O4/碳纳米管（CM），以未加石油的土壤和未做处理的石油污染土壤为对照。

对不同处理方式前后的土壤进行土壤含水量，土壤有机质测定。其中土壤含水量测定为常规测定方法，土壤有机质的测定（铵态氮和有效磷）采用河南云飞科技发展有限公司的YF300 土壤养分检测仪测定。

1.2.4 不同处理方式下石油降解率的测定

利用三点取样法称取5 g 带原油的土壤，使用10 mL 石油醚与土壤剩余的原油一并倒入分液漏斗中，加盖充分振摇2 min 并注意放气，静置分层2 min；用石油醚层将培养液反复萃取3 次，将萃取液放在塞有少许脱脂棉且上面放有无水硫酸钠的漏斗过滤，过滤液放置至50 mL 定容瓶中，并用石油醚进行定容。定容液用紫外分光光度计在600 nm 条件下测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 多壁碳纳米管磁处理前后的表征

2.1.1 SEM 结果

采用场发射扫描电镜（SEM）对多壁碳纳米管（CMT）、MnFe2O4/碳纳米管（CM）与Fe3O4/碳纳米管（CF）表面形貌进行观察，结果如下图所示。图1 显示三种多壁碳纳米管均呈无规则聚集，且之间存在许多网状空隙。图1-a 显示多壁碳纳米管表面光滑，几乎没有黑色粒状的杂质。图1-c 显示MnFe2O4/碳纳米管（CM）附着了少量的黑色颗粒状物质，而图1-b显示Fe3O4/碳纳米管（CF）则附着大量黑色颗粒状物质，导致Fe3O4/碳纳米管（CF）表面相较于多壁碳纳米管（CMT）更加粗糙。

图1 不同多壁碳纳米管的SEM 图Fig.1 SEM images of different multi-walled carbon nanotubes

2.1.2 FTIR 结果

通过傅里叶红外光谱（FTIR）对多壁碳纳米管（CMT）、Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）与MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）进行表征。根据图2 可知，多壁碳纳米管（CMT）在1 630 cm-1处出现了强烈的C=O 振动收缩峰，由此说明多壁碳纳米管的表面含有-COOH 和-OH 的表面官能团。与多壁碳纳米管（CMT）的FTIR图相比显示，Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）与MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）均在560 cm-1出现Fe-O 的振动收缩峰，由此可证明，有磁性物质成功附着在碳纳米管的表面。除此之外，Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）与MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）中2 850 cm-1处的振动吸收峰O-H 的消失可能是因为多壁碳纳米管（CMT）的部分结构被改变[14]。

图2 不同多壁碳纳米管的FTIR 谱图Fig.2 FTIR images of different multi-walled carbon nanotubes

2.1.3 Zeta 结果

Zeta 电位能够测定吸附剂表面电荷性，当吸附剂表面的阳离子数量多于阴离子数量时，表面带正电荷，当阴离子数量多于阳离子数量时，则表面带负电荷[15]。从图3 中可以发现将磁性介质加入到多壁碳纳米管（CMT）后，Zeta 电位明显向负电位偏移，说明Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）与MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）表面电荷均为负电荷，且MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）的Zeta 电位低于Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）的Zeta 电位，由此可说明，磁性介质会影响多壁碳纳米管的聚集强度，且MnFe2O4/多壁碳纳米管相比于Fe3O4/多壁碳纳米管在更大程度上改变了多壁碳纳米管的胶体分散系的稳定性，即MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）稳定性更好。

图3 不同多壁碳纳米管的Zeta 电位图Fig.3 Zeta images of different multi-walled carbon nanotubes

2.1.4 XPS 结果

X 射线光电子能谱（XPS）能够对不同多壁碳纳米管表面的元素进行鉴定分析[16-17]。根据图4 可知，多壁碳纳米管（CMT）、Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）与MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）的XPS 图谱均出现了C1s 和O1s 的伸缩振动峰，由此说明，赋磁前后的多壁碳纳米管表面的主要元素都为碳和氧。其次，Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）与MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）的XPS 图谱都观察到Fe2p 的伸缩振动峰，表明磁性介质已与多壁碳纳米管（CMT）相结合[18]。

图4 不同多壁碳纳米管的XPS 图Fig.4 XPS images of different multi-walled carbon nanotubes

2.2 不同处理条件对土壤理化性质的影响

2.2.1 不同处理条件对土壤含水量的影响

土壤含水量的变化可以代表石油污染土壤环境的改善程度。被石油污染以及投放石油降解菌和磁性碳纳米管的土壤含水量如表1 所示。从表1 中可以观察到空白组（未被石油污染）土壤含水量为46.02%，当土壤与石油混合后，含水量显著下降，这是由于石油污染物具有疏水性强，密度小，黏性强等特点，致使石油与土壤颗粒粘连在一起，堵塞土壤孔道，从而导致土壤蓄水能力不足[19]。除空白组外，其余均是被石油污染7 天后所测得土壤含水量。表1 结果显示，添加Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）的实验组中土壤含水量高于17%，添加MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）的实验组中土壤含水量则低于25%，即MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）所修复土壤的含水量普遍低于Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）所修复土壤的含水量。这说明Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）对石油的吸附效果相比于MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）更加明显。除此之外，还可以发现当LD23 与两种不同磁性碳纳米管晶体联合修复时，土壤含水量均能够保持最高。并且在SEM 表征结果分析中，CF 的表面要比CM 更加粗糙，即CF 的表面存在更多的磁性介质，大量的磁性介质颗粒有助于促进CF 吸附石油的效果。

表1 不同处理对土壤理化性质的影响Table 1 Effects of different treatments on soil water content

2.2.2 不同处理条件对土壤有机质的影响

表2 显示土壤中铵态氮和有效磷的含量在被石油污染后明显下降。7 d 后对比实验组与空白组发现添加LD23 的土壤相比于添加NYJ3.6 的土壤来说，其铵态氮和有效磷的含量较高一些，这可能是因为LD23 降解活性高于NYJ3.6，导致在此处理条件下，在石油污染土壤中LD23 活性更高。还可以观察到Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）修复的土壤的铵态氮和有效磷含量比MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）所修复土壤的含量要高得多，这可能因为Fe2O4/多壁碳纳米管（CF）的附磁晶体嵌入碳纳米管的效果要比MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）好，这与SEM 和FTIR 表征分析结果相一致。结果表明，同时添加LD23 与Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）石油污染土壤时，这将更利于石油污染土壤生态系统的修复。

表2 处理后的土壤有机质各项指标变化Table 2 Changes of indexes of soil organic matter after treatment

2.3 不同处理对石油降解率的影响

2.3.1 石油降解菌生长曲线的测定

由图5 可以看到，摇床培养14 h 后，石油降解菌NYJ3.6 和LD23 开始进入稳定期，将此时定义为向石油污染的土壤中投放菌株的最佳培养时间。

图5 石油降解菌NYJ3.6 和LD23 的生长曲线Fig.5 Growth curves of petroleum degrading bacteria NYJ3.6 and LD23

2.3.2 土壤中石油降解率的测定

根据表3 可以发现，同时添加NYJ3.6 和MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）至石油污染的土壤时，其石油降解率偏低；同时添加LD23 和Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）后，其石油降解效果最为明显。结果表明不同石油降解菌与多壁磁性碳纳米管联合修复效果比单加石油降解菌的修复效果显著增强，达到了预计的联合修复效果。这也可以说明添加MnFe2O4/多壁碳纳米管（CM）或者Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）后，能够为降解菌提供某些营养，有效促进两种石油降解菌的降解效果。

表3 土壤石油降解率测定结果Table 3 Determination results of soil oil degradation rate

3 讨论

许多研究表明，多壁碳纳米管由多层石墨烯构成且层与层之间有缺陷，相对于单层多壁碳纳米管来说更容易使得磁性氧化铁嵌入其中[20-21]。通过液相沉淀法制备磁性多壁碳纳米管后，再利用SEM、FTIR、Zeta、XPS 对改性前后的多壁碳纳米管进行表征分析，表征结果均可证明通过附加磁性氧化铁可以改变碳纳米管在水中的聚集程度，而且氧化基团的增加对于碳纳米管的稳定性具有很大的帮助。但由于制备工艺的限制导致MnFe2O4的结晶程度没有那么理想。Fe3O4/多壁碳纳米管的Zeta 电位与其相比较小可能是由于MnFe2O4晶体的合成温度比较高[22]。当石油泄漏渗透至土壤里，会导致土壤含水量降低，影响土壤本身的理化性质，致使土壤中所含有的一些土著菌无法进行正常的代谢活动，从而降低土著菌的石油降解率。研究中，多壁磁性碳纳米管的超顺磁性能够增大对土壤中的石油吸附效果，石油降解菌利用本身降解特性对土壤中的石油有效降解，物理修复与生物修复的联合促使土壤中石油更快的吸附和降解。除此之外，添加磁性多壁碳纳米管不仅可以吸附土壤中的石油，还可以为投入的部分石油降解菌提供一些营养元素，强化石油污染物的降解[23]。

4 结论

结果最终筛选得到LD23 和Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）、NYJ3.6 和Fe3O4/多壁碳纳米管（CF）两种微生物和物理的联合修复方法，这种联合修复技术不仅不会破坏土壤的土质，修复过程中还可以增加土壤中的有机质成分。

目前为止，对石油污染土壤的修复技术研究颇多，但是使用物理吸附载体即磁性多壁碳纳米管与石油降解微生物联合修复石油污染土壤的研究较少，为联合修复石油研究提供重要的数据。