连翘叶提取物通过PXR/CYP17A1 影响孕马血清促性腺激素在肝脏的代谢*

陈国雯，王中一，邱山桐，尤 婷，岳 涛，蒲思思，张雨星，王桂荣

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)是在怀孕母马血清中发现的一种重要的糖蛋白激素[1]，由马属(Equus)动物胎盘的尿囊绒毛膜细胞分泌，具有促进卵泡发育成熟、排卵等多种功能[2]。临床上，PMSG 常作为治疗母畜静止性发情、隐性发情、久配不孕等症状的兽用药物。研究表明：PMSG 代谢可对动物机体造成不同程度的影响。KARABULUT 等[3]研究发现：过量或频繁使用PMSG 时，肝脏、肾脏、卵巢、子宫等会出现损伤；LIN 等[4]研究发现：高剂量PMSG 会对体外受精小鼠胚胎的发育能力产生不利影响，并导致氧化应激诱导的非整倍性；邓凯伟等[5]研究发现：PMSG 代谢缓慢会影响动物发情。

肝脏是机体重要的代谢器官，药物进入机体后，主要由肝脏中的药物代谢酶进行分解代谢[6]。细胞色素酶P450 (cytochrome P450，CYP450)是电子传递链中的末端加氧酶，为含有1 个亚铁血红蛋白素辅助因子的超家族蛋白，是参与药物代谢的I 相代谢酶[7-8]。细胞色素酶P450 17A1 (cytochrome P450 17A1，CYP17A1)是CYP450 超家族成员之一，主要分布于细胞质中，在卵巢和肝脏中表达较多[9-10]；其作为合成雄激素的限速酶，参与早期卵泡生长发育，同时参与调节黄体颗粒细胞分泌孕酮[11]。孕烷X 受体(pregnane X receptor，PXR)是核受体家族的重要成员之一，由NR1I2基因编码[12]，属于配体激活的转录因子，主要在肝脏、小肠、胃、肾脏等组织中表达[13]，可调控药物代谢酶的表达，影响药物在肝脏的转运过程，从而影响其在机体的肝脏代谢，是机体对抗内外源物质的重要调控因子[14-15]，所以PXR 常被视为药物代谢的关键因子。

连翘(Forsythia suspensa)为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物，对药物性肝损伤具有潜在的治疗和保护作用，是中药临床常用传统药物，又名青翘、落翘等[16]。有研究发现：连翘叶中含有连翘苷、连翘酯苷A、连翘脂素等多种化学成分，其中连翘苷和连翘酯苷的含量远高于在连翘果中的含量[17]，这些化合物具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎、保肝、降低血糖和血脂等生物活性[18]。此外，范碧玥等[19]研究发现：连翘叶酶—醇提取物可以改善由对乙酰氨基酚造成的氧化应激。目前鲜有关于PMSG 在肝脏代谢的研究，且针对PMSG 代谢缓慢而造成的机体损伤还没有具体解决方案，本研究旨在探究连翘叶提取物对PMSG 在肝脏代谢的影响及其影响代谢的可能机制，以期改善在畜牧生产中因PMSG 代谢缓慢而造成的氧化应激。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

昆明雌鼠144 只，平均体质量(25±5) g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，饲养于22～26 ℃环境中。动物实验经甘肃农业大学伦理委员会批准(GAU-LC-2020-33)。

1.1.2 主要试剂

PMSG 购自宁波三生生物科技有限公司；连翘叶采自甘肃省天水市秦岭镇；兔抗CYP17A1抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗GAPDH 抗体和兔抗PXR 抗体购自美国affinity 公司；谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)测定试剂盒、谷丙转氨酶(cerealthirdtransaminase，ALT)测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)测定试剂盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)测定试剂盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；RIPA 裂解液购自北京索莱宝生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 连翘叶提取物的制备

采用半仿生酶醇法提取连翘叶有效成分。称取连翘叶粉末30 g，按料液比1∶8 (g∶mL)加入60%乙醇240 mL，密封后浸泡30 min，68 ℃水浴回流1 h，抽滤后收集滤液；在所得滤渣中加入纤维素酶0.15 g 和60%乙醇240 mL，50 ℃水浴回流2 h，抽滤后收集滤液。合并2 次所得滤液，50 ℃旋转蒸发，蒸发浓缩后于-80 ℃冷冻过夜，再用冷冻干燥机冻干72 h，收集连翘叶冻干粉末，做好标记后放置于干燥阴凉处备用。

1.2.2 动物分组与处理

取连翘叶提取物粉末溶解于0.5%羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose，CMC)中，分别配制成100、200 和400 mg/kg 的药液；将PMSG 用生理盐水稀释，于4 ℃保存备用。适应性喂养1周后，将144 只昆明小鼠随机分成6 组，分别为正常对照组(NC 组)、PMSG 模型组(PMSG 组)、连翘叶提取物低剂量组(LFSLE+PMSG 组)、连翘叶提取物中剂量组(MFSLE+PMSG 组)、连翘叶提取物高剂量组(HFSLE+PMSG 组)和高剂量药物对照组(FSLE 组)。NC 组灌胃0.5% CMC 溶液，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG、HFSLE+PMSG和FSLE 组分别灌胃100、200、400 和400 mg/kg连翘叶提取物药液，每天2 次，连续4 d；末次灌胃12 h 后，除NC 组和FSLE 组外，其余各组分别腹腔注射10 IU PMSG，后分别于12、24 和48 h采集小鼠肝脏及血清样本，每次采集8 只小鼠。

1.2.3 血清PMSG 代谢水平的检测

取分离后的血清作为待测样本，按照PMSG酶联免疫分析试剂盒说明书进行操作，得到小鼠血清中PMSG 终质量浓度。

1.2.4 氧化应激指标的测定

采集小鼠肝脏，称取适量肝脏组织，按照质量(g)∶体积(mL)=1∶9 的比例加入9 倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆，用CT15RE日立卓上微量高速冷冻离心机(株式会社日立制作所)进行离心，检测GSH、SOD 和 MDA 水平的转速为2 500 r/min，检测H2O2水平的转速为10 000 r/min，之后取上清备用，严格按照试剂盒说明书进行操作，测定SOD 活性以及GSH、MDA和H2O2的含量。

1.2.5 小鼠肝脏中PXR 和CYP17A1 蛋白表达的检测

分别取各组小鼠肝脏20 mg，加入RIPA 裂解液200 μL，采用冷冻型组织研磨器充分研磨后28 820 r/min 离心5 min，取上清液即为蛋白原液；加入5×蛋白上样缓冲液50 μL，混合均匀，于100 ℃恒温变性蛋白10 min。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法转膜，后用脱脂牛奶进行封闭，于4 ℃一抗孵育过夜(GAPDH 1∶4 000 稀释；PXR 1∶1 500 稀释；CYP17A1 1∶1 000 稀释)，加入二抗室温孵育，后用AmershamImager600 全自动化学发光成像系统(美国GE 公司)进行曝光，利用ImageJ 分析灰度值，进而得到PXR 和CYP17A1 的蛋白表达量。

1.2.6 数据统计与分析

使用SPSS 21 分析数据，采用单因素方差(one-way ANOVA)分析组间差异；使用Graphpad Prism 9.0 绘图。

2 结果与分析

2.1 连翘叶提取物对小鼠血清中PMSG 代谢水平的影响

由图1 可知：与NC 组相比，处理12、24 和48 h 后PMSG 组小鼠血清PMSG 水平极显著升高(P＜0.01)；与PMSG 组相比，处理12、24 和48 h后LFSLE+PMSG 组、MFSLE+PMSG 组和HFSLE+PMSG 组小鼠血清PMSG 水平均显著或极显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)；而不同处理时间下、同一处理组之间小鼠血清PMSG 水平均无显著差异。说明连翘叶提取物可显著降低不同处理时间段小鼠血清中的PMSG 水平，加快PMSG 在小鼠肝脏的代谢，且HFSLE+PMSG 组效果最佳。

图1 连翘叶提取物对PMSG 代谢水平的影响Fig.1 Effects of Forsythia suspensa leaves extract (FSLE)on the metabolic level of PMSG

2.2 连翘叶提取物对小鼠肝脏氧化应激水平的影响

由图2 可知：与NC 组相比，处理12、24 和48 h 后PMSG 组小鼠肝脏中SOD 活性和GSH 含量极显著降低(P＜0.01)，MDA 和H2O2含量极显著升高(P＜0.01)。与PMSG 组相比，小鼠给药12 h后，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 组小鼠肝脏中SOD 活性显著或极显著增强(P＜0.05 或P＜0.01)、MDA 含量极显著降低(P＜0.01)、H2O2含量显著或极显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)，MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 组的GSH 含量显著或极显著升高(P＜0.05 或P＜0.01)；小鼠给药24 h 后，MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 组小鼠肝组织中SOD 活性显著或极显著增强(P＜0.05 或P＜0.01)，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 组的GSH 含量显著或极显著升高(P＜0.05 或P＜0.01)、MDA 和H2O2含量极显著降低(P＜0.01)；小鼠给药48 h 后，MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 组小鼠肝脏中SOD 活性极显著升高(P＜0.01)、GSH 含量显著或极显著升高(P＜0.05 或P＜0.01)，LFSLE+PMSG、MFSLE+PMSG和HFSLE+PMSG 组的MDA 和H2O2含量显著或极显著降低(P＜0.05 或P＜0.01)。综上所述，连翘叶提取物可显著提高SOD 活性和GSH 含量、显著降低MDA 和H2O2含量，改善因PMSG 代谢而引起的氧化应激，且MFSLE+PMSG 和HFSLE+PMSG 组效果最佳。

2.3 连翘叶提取物对小鼠肝脏CYP17A1 蛋白表达水平的影响

由图3 可知：与NC 组相比，处理12 h 后PMSG 组小鼠肝脏CYP17A1 蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01)，处理24 和48 h 后显著升高(P＜0.05)；与PMSG 组相比，处理12 和48 h 后HFSLE+PMSG组小鼠肝脏CYP17A1 蛋白水平均极显著降低(P＜0.01)，处理24 h 后MFSLE+PMSG 组CYP17A1 蛋白水平显著降低(P＜0.05)，处理48 h 后MFSLE+PMSG 组CYP17A1 蛋白水平极显著降低(P＜0.01)。说明连翘叶提取物可显著下调小鼠肝组织中CYP17A1 蛋白的表达，且HFSLE+PMSG 组效果最明显。

2.4 连翘叶提取物对小鼠肝脏PXR 蛋白表达水平的影响

由图4 可知：与NC 组相比，处理12、24 和48 h 后PMSG 组小鼠肝脏PXR 蛋白表达水平显著升高(P＜0.05)；与PMSG 组相比，处理12 h 后MFSLE+PMSG 组PXR 蛋白水平显著降低(P＜0.05)，处理24 h 后LFSLE+PMSG 组蛋白水平显著降低(P＜0.05)，处理48 h 后LFSLE+PMSG 组PXR 蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)。说明连翘叶提取物可显著下调小鼠肝脏中PXR 蛋白的表达，且LFSLE+PMSG 组效果最明显。

图4 连翘叶提取物对小鼠肝脏PXR 蛋白表达的影响Fig.4 Effects of FSLE on the PXR protein expression levels in mouse liver

3 讨论

孕马血清促性腺激素(PMSG)通常被用于提高动物的繁殖力[20]，在畜牧业生产中占据重要地位。由于PMSG 分子中N-乙酰-神经氨酸的含量较高，导致其在动物血液中的半衰期较长，一般为40～150 h[21]。有研究表明：由于PMSG 代谢较慢，长时间存在于动物机体内会引发卵巢囊肿[22]；PARK 等[23]研究也发现：PMSG 在动物机体代谢过程中会诱导氧化应激的发生。为了减少PMSG在畜牧生产使用中对动物机体造成的伤害，研究生产可以加快PMSG 代谢的药物尤为重要。本研究表明：注射PMSG 12、24 和48 h 后，小鼠血清中PMSG 水平极显著升高，而连翘叶提取物可以显著降低小鼠血清中PMSG 水平，表明连翘叶提取物可以加速PMSG 在小鼠肝脏的代谢。这一结果可为解决PMSG 因代谢缓慢而造成的机体损伤提供参考，也为其他药物因代谢而引起的动物机体氧化应激和代谢性疾病研究提供解决途径。

氧化应激是机体抵御外源性有害物质攻击的自我保护方式，同时也是调控有害物质攻击机体的复杂过程[24]。机体发生氧化应激反应时会产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，当ROS 的含量大于正常水平时会破坏细胞内蛋白质、脂质、DNA 等生物大分子的结构，从而发生脂质过氧化反应[25]。GSH 是一种水溶性的抗氧化物，其活性巯基结构是重要的功能基团，可维持机体内氧化还原平衡，抵抗氧化应激损伤[26]。SOD 是体内催化歧化反应的一种抗氧化保护酶，对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要的作用，它可通过歧化反应将氧自由基转变为H2O2和O2[27]，其强弱在一定程度上可反映机体对抗氧化应激的能力。MDA 由机体氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化而产生，其含量反映机体内脂质过氧化及细胞损伤的程度[28]。本研究表明：注射PMSG 12、24 和48 h 后，小鼠肝组织中SOD 和GSH 水平均显著降低、MDA 和H2O2水平均显著升高，但连翘叶提取物可显著提高SOD 和GSH 水平并显著降低MDA 和H2O2水平，与安志霞等[29]的研究结果基本一致，表明连翘叶提取物具有良好的抗氧化作用，可以明显改善动物机体因PMSG 代谢而引起的氧化应激。

CYP450 是I 相代谢酶，主要参与药物代谢[30]。CYP17A1 作为其家族成员之一，可以在肝脏高表达，CYP17A1 编码产生的P450c17 蛋白具有17a-羟化酶和17,20-碳链裂解酶活性，是类固醇激素合成途径的关键酶[31]。KONG 等[32]研究发现：CYP17A1 酶活性高表达可以触发ROS 在机体内大量积累，从而引起机体发生氧化应激；王旭等[33]研究表明：CYP17A1 上调时可以引起肾脏发生氧化应激；本研究也表明：小鼠注射PMSG后CYP17A1 蛋白表达水平上调，同时诱导机体发生氧化应激。给予小鼠不同含量的连翘叶提取物，CYP17A1 蛋白表达水平下调，表明连翘叶提取物可以通过下调CYP17A1 来缓解PMSG 对CYP17A1 上调诱导的氧化应激反应，这为连翘叶提取物可缓解因药物代谢引起的氧化应激提供了更有利的证据。

PXR 是肝脏解毒的重要核转录因子，也是调控CYP450 家族基因转录的关键因子，可影响外源性物质的毒性[34]。PXR 也被称为类固醇和异源感应核受体，最初在小鼠中被发现，可被天然类固醇(如孕烯醇酮和孕酮)以及合成糖皮质激素激动剂和拮抗剂激活，在肝脏和肠道高度表达[35-36]。PXR 可通过调节其下游靶基因的表达直接参与机体脂质、胆固醇和糖代谢，维持机体内环境的稳态[37]。KIM 等[38]研究发现：PXR 上调伴有氧化应激的发生；本研究也显示：小鼠注射PMSG 后PXR 蛋白表达水平上调，同时伴有小鼠机体的氧化应激；给予小鼠不同含量的连翘叶提取物药液后PXR 蛋白表达水平下调，表明连翘叶提取物可以通过下调PXR 的表达来缓解PMSG 诱导的氧化应激。

4 结论

PMSG 代谢会引起小鼠机体发生氧化应激，连翘叶提取物可以加速PMSG 的代谢，并可以通过下调CYP17A1 和PXR 蛋白的表达减缓PMSG诱导的氧化应激。