非小细胞肺癌ctDNA 监测耐药相关伴随基因研究进展

薛崇祥，张 旭，鲁星妤，崔慧娟

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中日友好医院/国家呼吸医学中心/国家中西医结合医学中心 中西医结合肿瘤内科，北京 100029）

肺癌是全球癌症死亡的首要原因，其中非小细胞 肺 癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）约 占85%［1］。EGFR是NSCLC 患 者 中 最 常 见 的 驱 动 基因，突变频率可达48%～56%，亚洲女性人群中突变率甚至更高［2］。以表皮生长因子抑制剂（epidermal growth factor receptor inhibitors， EGFRIs）为代表的肺癌靶向药物，显著提高了患者的生存获益［3］。

精准的分子分型是NSCLC 靶向治疗的基础条件，所以准确、可靠的基因检测方法对靶向用药的患者筛选及临床预后监测具有积极意义。EGFR 是最早发现的驱动基因，1990 年首个EGFR 抑制剂苯胺基喹唑啉诞生。2003 年，吉非替尼作为首个小分子EGFR 酪氨酸激酶抑制剂研发成功，并于2005 年在国内上市，肺癌靶向治疗时代开启［4］。同年，“钻石突变”ALK 融合突变被发现，2010 年首个ALK 抑制剂克唑替尼研发上市，2013 年国内外指南开始推荐将ALK 与EGFR 纳入治疗前检测［5］。ROS1 融合基因于2007 年由Rikova 等［4］首次发现，2016 年纳入美国临床实践指南推荐。后续NSCLC 分子靶点的研究及相应靶向药物开发不断推进，越来越多的驱动基因及伴随基因被发现。按最新指南推荐，肺腺癌患者驱动基因检测内容已扩展为至少包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、RET、NTRK、MET、HER-2 等基因［6］。

通过对组织样本或体液标本进行基因检测，携带特定驱动基因的患者可以选择针对该驱动基因的靶向药物，并可以科学地预测用药效果以及副作用。其中，外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA， ctDNA）是目前肿瘤液体活检最主要的标本来源，已成为肿瘤基因检测的有力手段［7］。有研究表明，放化疗等治疗方式可能会影响EGFR 突变的状态，可见肺癌基因检测结果并非都是一成不变的［8］。因此，初始标本所检测的基因突变状态可能不足以预测一线化疗后的药物疗效，所以需要动态监测患者的基因突变状态［8，9］。另一方面，尽管驱动基因阳性NSCLC 患者对特定靶向药物的客观缓解率较高，但几乎所有患者均会出现耐药。随着二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）的发展，耐药后的伴随基因突变检测对于早期耐药预警、后续治疗指导以及肺癌病人的全程管理和长期获益具有重要影响。因此，本文就非小细胞肺癌ctDNA 动态监测及耐药相关伴随基因研究进展作一综述。

1 临床上常见的基因检测方式

ctDNA 检测的方法主要包括Sanger 测序、即时定量PCR（qRT-PCR）、NGS 等，各有不同优缺点，需根据检测内容及临床需求选择恰当的检测方法［10］。

1.1 Sanger 测序法

即双脱氧链末端终止测序法，是最原始的一代基因测序技术。Sanger 测序读取片段较长，准确度接近100%，早期广泛应用于EGFR 等基因突变检测。单次检测可覆盖已知少量突变位点，检测速度快，但如需检测多位点突变情况需要大量宝贵的样本多次检测［11］。另外，Sanger 测序的灵敏度不足，容易产生样本稀释甚至污染，已不能满足现阶段临床基因检测的现实需求［12］。

1.2 qRT-PCR

qRT-PCR 检测的基础是已知基因突变类型设计的引物探针，费用相对低廉，检测流程和判读结果简捷，通过闭管操作改进Sanger 测序扩增产物污染的不足，便于临床实际开展，于是成为目前基因检测常用方法之一［13］。虽然灵敏度相对较高，但qRT-PCR 检测无法检测出所有可能的突变；对肺癌早期或低DNA 脱落肿瘤细胞状态患者的基因检测来说，也仍具有一定挑战性［14］。

1.3 NGS 技术

NGS 属于高通量测序技术，灵敏度高，所需检测样本量小，以其在DNA 及RNA 水平上可进行多位点、广深度且同时检测的优势，逐步成为肺癌分子病理临床检测领域的主流［6］。相较于传统测序技术，NGS 技术可以检测重要的未知罕见伴随突变，涉及多种变异类型，为NSCLC 患者的全程管理提供更加全面可靠的诊疗依据［15］。而且，NGS 技术还可同时检测免疫治疗相关指标，而且也是目前分子残留病灶的主要检测方法，占据临床诊断与科研热点前沿［16］。

然而，NGS 并非绝对完美。技术层面上，NGS测序步骤多、程序复杂，读长较之前的方法更短，后续数据拼接难度增加，且结果的判读对于生物信息的准确分析具有依赖性。目前，基因检测市场并不规范，第三方检测标本缺乏病理科质控而造成结果准确性参差不齐。可及性方面，因NGS 检测对设备和技术要求较高，故而检测费用也相对较高，并未全部纳入医保，患者的经济负担相对更大，所以还难以全面普及［17］。

2 ctDNA 检测在NSCLC 诊治中的作用及优势

2.1 ctDNA 检测可作为组织学检测的替代或联合手段

由于相当一部分患者尚无法获取足够组织标本，则推荐外周血ctDNA 活检，以弥补样本不足和不可及性［6］。在NSCLC 中，外周血ctDNA 检测能够较好地反映当前患者的肿瘤负荷与基因突变状态，已成为组织检测的有效代替，两者的临床指导价值相当［18］。且组织+ctDNA 联合检测（35.8%）对比仅单纯组织检测（20.5%）或仅ctDNA 检测（28.8%），驱动基因检出率更高［19］。

2.2 ctDNA 检测可作为早期肺癌患者病理分型及术后复发监测补充

对于早中期肺癌患者，与影像学检测同时，基于NGS 技术的ctDNA 图谱在早期NSCLC 病理亚型分类中也具有潜在的应用价值［20］。手术后ctDNA 动态监测在预测复发方面相比于影像学更早，未来甚至或许能发挥蛋白类肿瘤标志物的作用，用于监测肺癌高危患者的肿瘤复发风险［21］。

2.3 ctDNA 检测可协助预测临床治疗疗效

目前肺癌治疗的疗效评估仍主要依据影像学Recist 或iRecist 标准进行评价，但传统影像学手段难以预测患者的预后，且存在滞后效应和辐射损伤风险［22，23］。晚期肺癌患者肿瘤负荷更大，初诊时外周血ctDNA 浓度一般更高；经治疗后其ctDNA 显著降低，则其对放化疗敏感，说明临床治疗有效［24］。但对于局部晚期肺癌患者，倘若治疗前ctDNA 就为阴性，可能是肿瘤ctDNA 因位置局限的原因未释放到血液中，或此时外周血ctDNA 无法反映肿瘤真实状态。一项真实世界研究［25］验证了ctDNA 监测对肺癌治疗中的疗效预测价值，基线ctDNA 状态与患者总生存期（overall survival， OS）呈负相关，ctDNA清除可作为临床获益的预测依据之一。有研究发现［26，27］，相对于常规影像学检查，ctDNA 监测能够提前4～9 周时间判断治疗效果，并可能弥补影像学评效的不足，所以ctDNA 监测更具优势。

3 NGS 检测在ctDNA 监测中优势明显

目前NGS 技术不仅可以一次性获得大量肿瘤组织内部变异信息，还具备了足够的灵敏性进行ctDNA 的基因变异检测，为我们从基因水平深入了解肿瘤复发提供了坚实的技术基础［28］。

3.1 NGS 检测技术可靠，准确性高

在国内外研究中，Tuononen 等［29］和支修益等［30］团队先后对肿瘤组织样本进行了NGS 和qPCR 技术检测比较，结果发现两者检测灵敏度和准确率相似，且NGS 技术提供的基因突变信息更加丰富、精确。目前，越来越多的实体瘤NGS 伴随诊断产品获批，以Guardant 360 CDx 为例，其在组织和液体活检结果一致性98.2% 以上，ctDNA 阳性预测值100%［31］。

3.2 NGS 检测范围广泛，一网打尽

NGS 技术的检测通量和单碱基成本均优于Sanger 测序，甚至能够检测ROS1 重排、MET 扩增、NTRK 融合、NGR1 融合等PCR 法无法检测的罕见突变［28］。对于ALK 等适用于免疫组化或荧光原位杂交检测的特定基因，NGS 检测则可避免多基因不同检测方法的重复，节省检测成本和时间［32］。随着检测技术的进步，更大panel 的伴随基因诊断产品逐渐从研究走向市场，实现NSCLC 驱动基因与伴随基因一网打尽的目的。

3.3 NGS 监测肿瘤耐药，精准预测

NGS 检测助力临床用药，能实时监测肿瘤疗效，早期发现NSCLC 耐药突变靶点，并协助研究者对 耐 药 机 制 进 行 深 入 探 索［33，34］。NGS 检 测 指 导 临床决策者及时调整患者的个性化治疗方案，并为NSCLC 患者带来确实可靠的生存获益。而且，NGS 或取更广泛的基因图谱，是成药靶点与新药研发的重要途经［32］。

4 伴随基因诊断及临床意义

近年来，肺癌少见基因变异被逐渐鉴定，靶向药物获得性耐药机制也随之更加完善，临床对基因检测提出了更高需求。ctDNA 检测允许患者可实时取样评估病情，对于监测NSCLC 伴随基因动态变化具有明显优势。如此，患者可及时掌握肿瘤状态和病情变化，提高疗效评价准确度，从而更好地及时调整治疗方案［19］。国内外各大指南均建议使用更大panel 的基因检测产品以获取更多基因图谱信息，识别罕见变异或耐药相关伴随基因，确定可用于临床治疗靶点［32］。

从基因层面来说，EGFR 突变合并其他伴随基因突变，容易导致下游或旁路信号通路激活［35］。检测出的伴随基因突变越多，越容易出现EGFR-TKI耐药［35-37］。

肺癌伴随基因谱系主要包括TP53、KRAS、ERBB2、MET、NRAS、BRAF 等，肺鳞癌中伴随基因 多 见 中FGFR1 扩 增、PIK3CA 和BRAF 等，其 突变频率或可高达50%以上［38］。抑癌基因TP53 突变后损害基因监视功能，导致肿瘤的发生［39］。伴随TP53 基因突变的患者无进展生存期（progression free survival， PFS）和OS 明显缩短，提示TP53 伴随突变患者预后不良［39］。例如，BENEFIT 研究发现仅存在EGFR 敏感突变患者，PFS 可达13.2 个月，合并TP53 突变组PFS 减少为9.3 个月［37］。Blakely等［40］将1 122 例 晚 期EGFR 突 变 型 与944 例EGFR野生型肺癌患者ctDNA 检测结果对比，鉴定出PIK3A、BRAF、MET、MYC、CDK6 和CTNNB1 等具有功能意义的伴随基因，而CTNNB1 或PIK3CA等伴随突变通过协同作用以利于肿瘤耐药和转移的发生。

总之，伴随突变对NSCLC 的预后差异有较大影响，临床上应根据不同分子分型结果，并结合患者实际情况制定个体化治疗方案，从而更有利于控制疾病进程，提高患者生存获益［41，42］。

5 总结

对NSCLC 患者进行ctDNA 动态监测，不仅能够帮助研究经典驱动基因突变对靶向治疗疗效获益的影响，还能够识别非经典伴随基因突变的致病差异以及对临床预后的影响。临床对外周血液体活检标准制定和质量控制尚未统一，仍然需要改进基因检测技术，以提高其精确性、及时性和临床实用性。而且，仍有太多的伴随基因机制尚不清楚，未来对于伴随基因在临床用药和疗效监测中的实际意义、基因检测技术的优化提升等方面仍需深入研究，以期扩大靶向治疗的受益人群范围，改善患者预后与生活质量。

作者贡献度说明：

薛崇祥：文献的整理和文章撰写；张旭：文献资料检索与整理；鲁星妤：为本文写作思路提供了指导，参与了文献的搜索和文章修改；崔慧娟：负责论文设计、修改并审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。