岛叶通过GluA1 受体和腺苷酸环化酶1 参与调控大鼠头痛及相关焦虑行为*

李 扬 李晨浩 毛静瑞 张雯雯 马真捷 韩 珣 唐闻晶刘若卓 于生元△ 刘颖璐△

（1 解放军总医院第一医学中心神经内科医学部，北京 100853；2 解放军医学院，北京 100853；3 南开大学医学院，天津 300071）

偏头痛是全球最常见的神经系统疾病之一。根据最近的全球疾病负担分析，偏头痛是第二大致失能性疾病，在50 岁以下的女性中则位居第一[1]。本团队的一项入户调查显示，中国人群偏头痛的年患病率为9.3%，预计年损失高达 3317 亿元人民币[2]。其中，慢性偏头痛(chronic migraine, CM)能导致更严重的失能表现，且多与焦虑、抑郁等精神疾病共患，部分病人治疗效果欠佳，严重影响生活质量，为家庭及社会带来了严重的医疗和经济负担[3,4]。

有研究显示偏头痛是一种脑功能障碍性疾病，涉及前扣带回(anterior cingulate cortex, ACC)、岛叶、三叉神经脊束核等多个脑区[5]。其中岛叶在大脑功能中具有重要地位，参与包括神经病理性疼痛和炎性痛在内的多种类型疼痛的调控[6,7]，但岛叶与偏头痛发病机制的关联研究却很少报道。在一项脑功能成像研究中显示，CM 病人的病程长短与前岛叶和背内侧丘脑，前岛叶和中脑导水管周围灰质之间的功能连接强度显著相关[8]。另一项研究表明，在患有偏头痛的女性病人中，其岛叶皮质厚度较同龄健康女性增厚[9]。但偏头痛发病机制中具体通过什么途径影响岛叶结构和（或）功能变化尚未可知。此外，岛叶是参与认知与情绪调节的重要脑区[6]。一项临床研究显示，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂和行为认知疗法可减少病人岛叶和杏仁核在焦虑和抑郁发病期间的活动，且岛叶和杏仁核活动的减少程度与焦虑症状的减少情况呈正相关[10]。然而，岛叶在偏头痛病理情况下是否仍能调节相关焦虑等情绪行为尚不清楚。

既往研究表明，谷氨酸受体及其相关信号分子积极参与疼痛及焦虑抑郁等情绪障碍的发生与调节[10,11]。其中，在小鼠神经结扎的慢性疼痛模型中发现，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(alphaamino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid,AMPA)受体亚基1-GluA1 上调和磷酸化改变可导致岛叶神经元的兴奋性增强[12]。Mcginnis 等[13]研究表明，小鼠酒精戒断引起的焦虑情绪与AMPA 受体介导的岛叶-杏仁核通路相关。基于此，我们推测岛叶可能通过谷氨酸受体，尤其是AMPA 受体参与调控偏头痛及相关焦虑行为。

环腺苷酸(cyclic AMP, cAMP)作为细胞内关键的第二信使，在学习和记忆、慢性疼痛、情绪恐惧和药物滥用等生理功能中起重要作用[14]。腺苷酸环化酶(adenylate cyclase, AC)具有多个分类亚型，可在细胞内将ATP 催化生成cAMP。其中，AC1主要在神经系统中表达，且与AMPA 受体存在相互调节作用[14～16]。在慢性疼痛模型动物中发现，AMPA 受体介导钙离子与钙调蛋白结合，使AC1通过激活cAMP 增加蛋白激酶A (protein kinase A,PKA)的表达，激活的PKA 可进一步影响AMPA 受体及其磷酸化的表达变化，因此，AC1 在AMPA受体相关的信号通路中具有重要作用[15～17]。据报道，同时敲除小鼠的AC1 和AC8 基因可表现出明显的镇痛作用，缓解其炎性痛、深部肌肉疼痛和神经病理性疼痛，而仅敲除小鼠的AC1 基因，除镇痛作用外，其运动功能、记忆及情绪表现与正常小鼠相比无明显变化。实验证实，AC1 的抑制剂NB001(5-[[2-(6-Amino-9H-purin-9-yl)ethyl]amino]-1-ol)

亦可在动物模型中缓解多种疼痛表现[18]。基于此，本研究首次应用CM 动物模型，通过行为学和组织学等方法探究岛叶在偏头痛及相关焦虑行为中的作用机制，旨在为理解偏头痛发病机制及未来新型治疗方案提供科学依据。

方 法

1.实验材料

实验动物：SPF 级成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠44 只，8～9 周龄，购自北京斯贝福生物技术有限公司[许可证号 SCXZ（京2019-0010）]，饲养在温度22～24℃、湿度40%～60%和光照（12 h光/暗循环）控制的环境中，允许自由获取食物和水。饲养1 周后用于实验。本研究通过中国人民解放军总医院医学伦理委员会审核，严格遵守动物实验伦理相关规定。

主要仪器及耗材：旷场设备（上海欣软）；vonFrey 纤毛机械刺激针套件(Anesthesio)；微量注射器（25 μl；10 μl；上海高鸽，平头）；药物注射套管套装（瑞沃德，62001、62002、62101、62102、62201、62202、62513）；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜（麦克林，IPFL00010）。

主要试剂：5-羟色胺(Sigma-Aldrich, H9523)；前列腺素 E2（麦克林，P860711）；组胺 (Sigma-Aldrich)；缓激肽（麦克林，B860429）；磷酸盐缓冲液 (PBS, Solarbio, P1010)。用PBS 溶液溶解配制成含有2 mM 5-羟色胺、0.2 mM 前列腺素 E2、2 mM 组胺、2 mM 缓激肽的炎症汤(inflammatory soup, IS)溶液。NB001（HTS 09836；卓敏教授实验室馈赠）。免疫印迹实验：一抗：c-Fos (1:1000, cell signaling technology, #2250)、GluA1 (1:50000, Proteintech, 67642-1-Ig)、p-GluA1-S845 (1:2000, cell signaling technology, #8084)、AC1 (1:1000, abcam,ab69597)和β-actin (1:3000, Proteintech, HRP-66009)。抗鼠/兔二抗(1:3000, Proteintech, SA00001-1, SA00001-2)。蛋白酶抑制剂混合物（碧云天，P1049-1）；磷酸酶抑制剂混合物（碧云天，P1049-2）；RIPA 裂解液（碧云天，P0013B）；BCA 蛋白含量检测试剂盒（翱擎，AQ526）；SDS-PAGE 预制胶（翱擎，AQ128-01）；1 min 快速封闭液（C220701，阳光英锐）。

2.实验方法

（1）CM 大鼠模型建立：造模方式与既往实验相同[19]。首先将SD 雄性大鼠用戊巴比妥钠 (50 mg/kg)腹腔麻醉，然后将大鼠固定在立体定位仪上，切开背侧皮肤，露出颅骨。在矢状缝右侧1.5 mm、前囟后方 1.5 mm 处钻直径 1 mm 的小孔用于置入给药套管（直径1 mm，长1mm），手术保证硬脑膜完整。随后用螺丝和牙科水泥固定给药套管，缝合头皮，仅在皮外露出给药套管帽。所有大鼠恢复2 天后用PBS 溶液检查给药套管是否通畅。手术成功的大鼠单笼饲养恢复7 天后进行实验。在大鼠清醒时，通过给药套管向硬膜输注10 μl IS 以刺激大鼠上矢状窦旁硬脑膜（共14 次，每日1 次）构建CM 大鼠模型（CM 组）。对照组（Con 组）在相同条件下向硬膜输注等体积PBS。每日在IS 或PBS 输注前5 min，通过vonFrey 纤维丝随机测定大鼠一侧眶周的机械阈值以验证造模效果。每组12 只大鼠，7 只用于行为学实验，5 只用于免疫印迹实验。实验流程见图1。

图1 实验流程图Fig.1 Flow chart of the experimental outline

（2）岛叶微量注射NB001：在固定IS 给药套管的同时，在双侧岛叶放置直径0.56 mm 的套管（左侧和右侧各 5.7 mm、距前囟 0 mm、长7.7 mm）。图2 箭头所示为双侧岛叶立体定位注射位置示意图。在第14 天，即停止IS 刺激1 天后开始进行岛叶立体定位注射，用微量注射器向双侧岛叶分别缓慢注射1 μl 选择性AC1 抑制剂 NB001 (10 mg/ml) 或生理盐水 (normal saline, NS)，每日1次，连续注射3天，即NB001 组和NS 组，每组10 只大鼠，5 只用于行为学实验（其中1 只在行为学实验结束后行免疫荧光染色查看岛叶注射位置），5 只用于免疫印迹实验。NB001 使用剂量及注射方法参考既往实验[16]。

图2 岛叶注射位置图脑组织冰冻切片免疫荧光染色。蓝色为DAPI 染色的细胞核；白色箭头标记为岛叶立体定位注射位置Fig.2 Layout diagram of insula injection Immunofluorescence staining was performed on frozen sections of brain tissue.DAPI stained nuclei are shown in blue; The white arrow indicates the sites of the insular stereotaxic injection.

（3）眶周机械阈值测定：每天（第0 至第17 天）在药物(IS/PBS/NB001/NS)输注前5 min，用vonFrey纤维丝 (1.0～26 g) 测量眶周机械阈值。测量前将每只大鼠置于塑料盒中适应30 min。测量时，将vonFrey 纤维丝垂直施加于眶周皮肤，直至纤维丝弯曲，并保持5 秒或直到大鼠表现出阳性反应。阳性反应包括头退缩、发声和前爪拨开纤维丝。选择3 个不同的眶周位置（外眦、眶上和前额）刺激[20]。当2个或3 个刺激点出现阳性反应时，将纤维丝的重量作为其眶周机械阈值。重复上述过程3 次。纤维丝由低刻度 (1.0 g) 开始向高刻度递增，同一刻度的纤维丝每个刺激位点测量1 次。对于26 g 的纤维丝无阳性反应的大鼠，将26 g 记录为其眶周机械阈值。

（4）旷场实验：实验全程在黑暗条件下进行。实验开始前将大鼠在黑暗的行为学分析室适应3～4 h。每只大鼠测试前用75%酒精溶液擦拭仪器消除嗅觉线索。旷场实验装置由一个圆形的黑色底座（直径120 cm）和周围的黑色墙壁（高40 cm）组成。内腔为直径90 cm 的圆，外空间为环形。将大鼠背向实验人员置于旷场中央，然后采用动物行为轨迹分析系统记录其活动，包括总路程、中央路程、进入中央区时间及次数，共记录5 min。在IS 给药第0天和第14 天对IS 组及PBS 组进行旷场行为观察。NB001 组及NS 组的旷场行为观察时间是IS 刺激第14 天及NB001 给药3 天后，即实验第17 天。

（5）高架十字迷宫(elevated plus maze, EPM)实验：EPM 实验环境及动物适应时间与旷场实验相同。EPM 装置由两个对立开放臂 (50 cm×10 cm)和两个对立闭合臂 (50 cm×10 cm×40 cm) 组成。迷宫中心是一个10 cm×10 cm 的开放区域，迷宫高出地面60 cm。在测试开始时，将大鼠背向实验人员置于EPM 的中央平台，使其面对其中一只开放臂。采用动物行为轨迹分析系统记录大鼠的总路程和开臂路程。各组大鼠进行高架十字迷宫实验的时间同旷场实验。

（6）免疫印迹实验：蛋白制备和蛋白印迹分析按照之前的方法进行[21]。简单来讲，在最后1 次药物(IS/PBS/NB001/NS)输注24～28 h 后（第14/17天），将双侧岛叶脑组织收集并放在-80℃保存直至使用。将大鼠脑组织用组织研磨仪低温 (0℃) 研磨后，用加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制的RIPA 裂解液在冰上充分裂解后，在4℃条件下离心获取上清。用BCA 试剂盒测定蛋白质浓度后，将其稀释至3 μg/μl。30 μg 蛋白质通过SDS-PAGE 凝胶进行分离并电转移至PVDF 膜。用快速封闭液将PVDF膜封闭1 min 后，使其与相应一抗及二抗相结合。使用HRP ECL 系统对蛋白条带进行可视化，然后ImageJ 1.53t 软件分析灰度值。

3.统计学分析

采用SPSS 26.0 软件（IBM Corp.，美国）进行统计分析，Prism 8.3 软件进行画图。采用Shapiro-Wilk检验分析数据分布情况，采用Levene 法检验方差齐性。两组间比较采用双尾独立样本t检验或双尾独立样本秩和检验。眶周机械阈值采用两因素重复测量方差分析，当数据不符合球形假设时，用Greenhouse-Geisser 进行校正。数据以均数±标准误(±SEM)表示，P＜ 0.05 表示差异有统计学意义。

结 果

1.CM 大鼠眶周痛觉过敏

CM 组和Con 组分析结果显示，药物IS 和硬膜给药次数存在交互作用[F(14, 168) = 12.86,P＜0.001]，IS [F(1, 12) = 71.29,P＜ 0.001] 和硬膜给药次数[F(4.46, 53.52) = 12.86,P＜ 0.001] 也分别对眶周机械阈值有影响。如图3A 所示，在硬膜给药前，即CM 组与Con 组（每组7 只）基线眶周机械阈值无显著差异(t= 0.066,P＞ 0.999)。在4 次IS 注射后，CM 组的眶周机械阈值明显比Con 组下降（第4 天：t= 4.594,P= 0.011）。从第4 天至第14 天，IS 组的眶周机械阈值始终比Con 组低（第14 天：t= 9.141,P＜ 0.001），且CM 造模完成时，CM 组大鼠眶周机械阈值已经稳定在低值，表示痛觉过敏。

图3 反复IS 刺激硬脑膜对大鼠眶周机械阈值及焦虑行为的影响（n = 7 只/组，±SEM）(A) 反复IS 刺激硬脑膜对大鼠眶周机械阈值的影响；(B) 各组大鼠的旷场活动轨迹代表图；(C) 各组大鼠旷场总路程对比；(D) 各组大鼠旷场中央路程对比；(E) 各组大鼠旷场中央时间对比；(F) 各组大鼠进入旷场中央区次数对比；(G) 各组大鼠高架十字迷宫活动轨迹代表图；(H) 各组大鼠在高架十字迷宫的总路程对比；(I) 各组大鼠在高架十字迷宫的开臂路程对比。#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, 与 Con 组相比；**P ＜ 0.01，与第0 天相比Fig.3 Effects of dural repeated IS stimulation on periorbital mechanical threshold and anxiety behaviors in rats (n = 7 rats/group,±SEM)(A) Effect of dural repeated IS stimulation on periorbital mechanical threshold in rats; (B) Representative open field activity tracks for each group of rats; (C) Comparison of total open field distance traveled by each group of rats; (D)Comparison of central open field distance traveled by each group of rats; (E) Comparison of time spent in the central open field by each group of rats; (F) Comparison of the number of entries into the central open field area by each group of rats; (G)Representative EPM activity tracks for each group of rats; (H) Comparison of total distance traveled by each group of rats in the EPM; (I) Comparison of the open-arm distance traveled by each group of rats in the EPM.#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, compared with the group Con；**P ＜ 0.01, compared with day 0.

2.CM 大鼠焦虑样行为增加

Con 组和CM 组大鼠（每组7 只）的旷场行为学记录显示，在给药前，总路程 (t= 0.564,P=0.583)、中央路程 (t= 0.509,P= 0.620)、中央区时间(Z= -0.575,P= 0.565) 及进入中央区次数 (t= 0.632,P= 0.539)均无显著差异。但在给药第14 天时，CM 组大鼠在旷场的总路程 (t= 6.610,P＜ 0.001)、中央路程 (t= 8.630,P＜ 0.001)、中央区时间 (t= 5.147,P＜ 0.001) 及进入中央区次数(t= 7.625,P＜ 0.001)均明显比Con 组减少。此外，第14 天时CM 组大鼠在旷场的总路程 (t= 5.867,P＜ 0.001)、中央路程(t= 9.043,P＜ 0.001)、中央区时间 (Z= -3.130,P=0.002) 及进入中央区次数 (t= 6.411,P＜ 0.001)均明显比基线减少（见图3B-3F）。

Con 组和CM 组大鼠（每组7 只）的EPM 实验结果显示，在给药前，总路程 (t= 0.825,P= 0.425)和开臂路程 (t= -0.542,P= 0.597) 均无显著差异。在IS 刺激14 次后，CM 组和Con 组大鼠在高架十字迷宫中的总路程 (t= 1.146,P= 0.274)无显著差异，但CM 组大鼠的开臂路程 (Z= -3.130,P= 0.002) 明显比Con 组减少。此外，第14 天时CM 组大鼠在高架十字迷宫的开臂路程 (Z= -3.130,P= 0.002) 明显较基线减少（见图3G-3I）。

3.CM 大鼠岛叶c-Fos、GluA1 及AC1 表达增加

在CM 造模完成后，取岛叶组织（见图4A）做免疫印迹检测。CM 组岛叶c-Fos 的蛋白表达量明显高于Con 组（每组5 只，t= 3.548,P= 0.008，见图4B, 4C）。同时，CM 组AC1 的表达也多于Con 组（每组5 只，t= 3.066,P= 0.015；见图4B, 4D）。最后，GluA1（每组5 只，t= 2.953,P= 0.018）及其磷酸化p-GluA1-S845（每组5 只，Z= -2.611,P= 0.009）在CM 组岛叶明显多于Con 组（见图4E-4G）。

图4 反复IS 硬膜刺激对岛叶的c-Fos、AC1、GluA1 及其磷酸化的影响（n = 5 只/组，±SEM）(A) 岛叶解剖位置图；(B) 免疫印迹法检测各组大鼠岛叶c-Fos 和AC1 蛋白表达的代表图；(C) CM 大鼠岛叶c-Fos蛋白表达变化经对照组归一化后的统计图；(D) CM 大鼠岛叶AC1 蛋白表达变化经对照组归一化后的统计图；(E)免疫印迹法检测各组大鼠岛叶GluA1 和p-GluA1-S845 蛋白表达的代表图；(F) CM 大鼠岛叶GluA1 蛋白表达变化经对照组归一化后的统计图；(G) CM 大鼠岛叶p-GluA1-S845 水平变化经对照组归一化后的统计图。#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, 与Con 组相比Fig.4 Effects of dural repeated IS stimulation on c-Fos, AC1, GluA1 and its phosphorylation in insula (n = 5 rats/group,±SEM)(A) Schematic diagram showed the location of insula.rhinal fissure (rf); (B) Representative images of c-Fos and AC1 protein expression in the insula of each group, detected by western blot test; (C) Graph showing normalized changes in c-Fos protein expression in the insula of CM rats; (D) Graph showing normalized changes in AC1 protein expression in the insula of CM rats; (E) Representative images of GluA1 and p-GluA1-S845 expression in the insula of each group,detected by western blot test; (F) Graph showing normalized changes in GluA1 protein expression in the insula of CM rats; (G) Graph showing normalized changes in the level of p-GluA1-S845 in the insula of CM rats.#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, compared with the group Con.

4.NB001 岛叶注射可改善CM 大鼠眶周痛觉过敏及焦虑样行为

NB001 组和NS 组分析结果显示，药物NB001和NB001 给药次数存在交互作用 [F(3, 24) = 21.76,P＜ 0.001]，药物NB001 [F(1, 8) = 36.49,P＜ 0.001]和NB001 给药次数 [F(1.14, 9.12) = 24.67,P＜ 0.001]也分别对眶周机械阈值有影响。向CM 大鼠双侧岛叶注射1 次NB001 后，NB001 组大鼠的眶周机械阈值就较NS 组明显升高（每组5 只，第15 天：t=5.585,P= 0.014）。NB001 连续治疗3 次后，其眶周机械阈值上升的更加明显（每组5 只，第17 天：t= 5.337,P= 0.018），而NS组的阈值仍稳定在低值（见图5A）。

图5 双侧岛叶输注NB001 对CM 大鼠眶周机械阈值及焦虑行为的影响（n = 5 只/组，±SEM）(A) 双侧岛叶输注NB001 对CM 大鼠眶周机械阈值的影响（黑色箭头指示第1 次注射NB001，阴影部分表示统计比较时间）；(B) 各组大鼠的旷场活动轨迹代表图；(C)各组大鼠旷场总路程对比；(D)各组大鼠旷场中央路程对比；(E)各组大鼠旷场中央时间对比；(F) 各组大鼠进入旷场中央区次数对比；(G) 各组大鼠的高架十字迷宫活动轨迹代表图；(H) 各组大鼠在高架十字迷宫的总路程对比；(I) 各组大鼠在高架十字迷宫的开臂路程对比。#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, 与 Con 组相比；**P ＜ 0.01, 与第14 天相比Fig.5 Effect of bilateral insular infusion of NB001 on periorbital mechanical threshold and anxiety behaviors in CM rats (n = 5 rats/group,±SEM)(A) Effect of bilateral insular infusion of NB001 on periorbital mechanical threshold in CM rats (The black arrow indicates the first intraperitoneal injection of NB001.The shaded area indicates statistical comparison times); (B) Representative open field activity tracks for each group of rats; (C) Comparison of total open field distance traveled by each group of rats;(D) Comparison of central open field distance traveled by each group of rats; (E) Comparison of time spent in the central open field by each group of rats; (F) Comparison of the number of entries into the central open field area by each group of rats; (G) Representative EPM activity tracks for each group of rats; (H) Comparison of total distance traveled by each group of rats in the EPM; (I) Comparison of the open-arm distance traveled by each group of rats in the EPM.#P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01, compared with the group Con; **P ＜ 0.01, compared with day 14.

NB001 组及NS 组大鼠在完成CM 造模时（第14 天，每组5 只），在旷场的总路程 (t= -0.189,P=0.854)、中央路程 (t= 0.561,P= 0.590)、中央区时间(t= 0.049,P= 0.962) 及进入中央区次数 (t= 0.290,P= 0.779) 差异无统计学意义。接受连续3 次NB001岛叶注射后（第17 天），NB001 组的总路程 (Z=-2.611,P= 0.009)、中央路程 (t= -7.265,P＜ 0.001)、中央区时间 (t= -7.100,P＜ 0.001) 及进入中央次数(t= -5.409,P= 0.001) 均较NS 组明显增加。且第17天时NB001 组的总路程(t= -3.864,P= 0.005)、中央路程(t= -6.699,P＜ 0.001)、中央区时间 (t= -6.157,P＜ 0.001) 和进入中央区次数 (t= -5.092,P= 0.001)均较基线明显增加（见图5B-5F）。

实验第14 天时，NB001 组和NS 组大鼠（每组5 只）在高架十字迷宫的总路程 (t= -0.363,P=0.726) 及开臂路程 (t= 0.231,P= 0.823) 差异无统计学意义。经过3 次连续NB001 岛叶注射治疗后，NB001 组大鼠在高架十字迷宫的总路程 (t= -1.846,P= 0.102) 和NS 组差异无统计学意义，但开臂路程(Z= -2.611,P= 0.009) 明显较NS 组增加。且此时NB001 组的开臂路程 (t= 0.486,P= 0.640) 也较治疗前明显增加（见图5G-5I）。

5.NB001 岛叶注射可减少CM 大鼠岛叶AC1表达，GluA1 表达及磷酸化

AC1 抑制剂NB001 连续3 次岛叶注射后（第17 天），其岛叶的AC1 表达明显较NS 组减少（每组5 只，t= 8.579,P＜ 0.001）。同时，NB001 组的GluA1 表达（每组5 只，t= 3.404,P= 0.009）及p-GluA1-S845, 即GluA1 磷酸化水平（每组5 只，t=4.245,P= 0.003）明显较NS 组减少（见图6）。

图6 双侧岛叶输注NB001 对CM 大鼠岛叶AC1、GluA1 及其磷酸化的影响（n = 5 只/组，±SEM）(A) 免疫印迹法检测各组大鼠岛叶GluA1 和p-GluA1-S845 蛋白表达的代表图； (B) NB001 组大鼠岛叶AC1 表达量经对照组归一化后的统计图；(C) NB001 组大鼠岛叶GluA1 蛋白表达变化经对照组归一化后的统计图；(D)NB001 组大鼠岛叶p-GluA1-S845 水平变化经对照组归一化后的统计图。##P ＜ 0.01, 与 Con 组相比Fig.6 Effect of bilateral insular infusion of NB001 on AC1, GluA1 and its phosphorylation in CM rats (n = 5 rats/group,±SEM)(A) Representative images of GluA1 and p-GluA1-S845 protein expression in the insula of each group, detected by western blot test; (B) Graph showing normalized changes in AC1 protein expression in the insula of rats from NB001 group; (C) Graph showing normalized changes in GluA1 protein expression in the insula of rats from NB001 group; (D)Graph showing normalized changes in the level of p-GluA1-S845 in the insula of rats from NB001 group.##P ＜ 0.01, compared with the group Con.

讨 论

在本研究中，发现大鼠硬脑膜重复IS 刺激可诱发偏头痛样症状和焦虑情绪行为。免疫印迹实验结果显示CM 组岛叶c-Fos 蛋白表达增加，同时GluA1 受体及其磷酸化p-GluA1-S845，以及AC1的表达均上调。CM 大鼠岛叶微注射AC1 抑制剂NB001能显著缓解大鼠的眶周痛觉过敏和焦虑行为，并降低岛叶AC1，GluA1 受体及其磷酸化p-GluA1-S845 的表达量。

本研究采用反复IS 刺激硬膜以激活三叉神经血管系统并产生偏头痛样疼痛[22]。结果表明反复IS硬脑膜刺激4次后，大鼠眶周机械阈值出现显著降低，并在第14 天时已经维持在低值。与既往的研究相比，本研究发现14 天的IS 硬膜刺激足以诱导成年大鼠出现稳定头部疼痛状态[19,23]。本研究检测了岛叶的c-Fos蛋白表达，这是一种可反映刺激后神经元激活的蛋白标志物[24]，结果发现CM 模型大鼠的岛叶c-Fos蛋白表达量明显高于Con 组。该结果与既往报道的颅脑核磁研究结果显示偏头痛病人及偏头痛模型动物的岛叶较对照组显著激活相一致[8,25]，可共同证明岛叶参与了偏头痛的疾病过程。

既往研究显示，AMPA 受体可以通过调节AC1参与内脏痛及癌痛等疼痛调控[26,27]。最新研究发现，大鼠ACC 通过抑制AC1 表达进而降低GluA1磷酸化水平能有效缓解大鼠偏头痛样疼痛[16]，作为和ACC 同样在痛觉调控中发挥重要作用的岛叶，其AC1 表达是否可以调控偏头痛相关表现尚无报道。因此，本研究检测了岛叶AMPA 的GluA1、p-GluA1-S845 及AC1 的表达量，发现GluA1、p-GluA1-S845 及AC1 均明显较对照组多。而双侧岛叶立体定位注射AC1 抑制剂 (NB001) 后，发现大鼠的偏头痛样疼痛显著缓解。同时显示，CM 组大鼠岛叶的GluA1 表达及磷酸化均明显升高，在应用NB001 岛叶立体定位注射后该变化有所缓解。由此，我们推测岛叶可通过GluA1 及AC1 调控偏头痛的病理生理机制。

除头部疼痛外，与焦虑等情绪共病也是非常值得关注的问题。在临床工作中，偏头痛病人常常合并焦虑抑郁等负性情绪[28]，因此，本研究观察了大鼠连续IS 硬膜刺激后是否也能产生焦虑样行为。结果表明，在连续硬膜刺激14 天后，大鼠在旷场及高架十字迷宫的焦虑样行为明显增加，这更加证实了偏头痛与焦虑疾病发病存在交叉或相互影响的机制。基于此，本研究发现在CM 大鼠中岛叶立体定位注射NB001 后，除了眶周机械阈值有所回升外，其焦虑情绪行为也得到了缓解，进一步证明岛叶可能通过调节GluA1 和AC1 影响CM 大鼠的痛阈和焦虑样行为。既往研究表明，小鼠急性偏头痛样疼痛发作不导致焦虑样行为，但偏头痛样疼痛持续发作导致中枢痛觉敏化，同时表现出焦虑行为[16]。根据先疼痛后焦虑的症状产生顺序，考虑NB001 可能通过缓解疼痛，进一步缓解焦虑行为。此外，有多项研究证明NB001 对生理性疼痛感知、认知和运动功能无明显影响，且无明显成瘾性[29]。其临床I 期研究的结果在健康成人中亦证实具有良好的安全性和耐受性[30]。因此，NB001 在治疗偏头痛及其相关焦虑行为方面具有潜在应用前景。

本研究首次在动物模型中发现了岛叶参与偏头痛及其相关焦虑情绪行为调控，且这一调控作用可能是通过影响岛叶GluA1 及AC1 实现的。但本研究仍存在以下不足之处：①岛叶立体定位给药方式存在较大创伤及风险，后续应完善腹腔注射、灌胃等更加安全的给药方式。②本实验所用模型虽为经典偏头痛动物模型，但在硝酸甘油诱发模型、左克洛卡林诱发模型等其他偏头痛模型共同验证下更具说服力。

综上所述，岛叶可能通过GluA1 及AC1 参与偏头痛及其相关焦虑的病理机制调控，AC1 抑制剂可缓解大鼠眶周痛觉敏化及焦虑样行为表现，具有临床转化及应用价值。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。