不同贮藏年限对红砂种子生理特性及胚结构的影响

李蒙 苏世平 张正中 李超群 陈君婵 李毅

摘 要 以室温贮藏条件下0～4 a的紅砂（Reaumuria soongorica）种子为试验材料，通过测定不同贮藏年限红砂种子的萌发指标、生理指标及种胚显微结构，探究红砂种子在贮藏老化过程中种子活力及其生理和显微结构的变化特征。结果表明：随着贮藏年限的增加，红砂种子芽长、萌发率、萌发势、 发芽指数、活力指数和含水量逐渐降低，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、可溶性糖（soluble sugar，SS）和可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量呈先升高后降低的趋势，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量逐渐上升。红砂种子萌发指标与MDA含量呈显著（P<0.05）负相关，与SS、SP呈正相关。当年采收的种子，胚部细胞排列紧密，贮藏3～4 a的种子胚部细胞排列散乱，木质化程度加深着色效果明显，并伴随子叶逐渐缩小的现象。综上认为，红砂种子含水量、MDA和SP含量可较为准确地反映其活力，且红砂种子活力变化的节点在2～3 a之间。在实际生产中，建议选择采收后室温贮藏1 a的种子为播种材料。

关键词 红砂种子；贮藏年限；种子活力；生理指标；种胚显微结构

种子是植物遗传资源的有效保存体，其在贮藏过程中内部结构和内含物都会发生一系列的变化[1]，主要表现在萌发特性、抗氧化酶活性、内部代谢物质含量（如可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛等）和细胞结构等方面[2]。贮藏时间是影响种子活力水平和萌发特性的主要因素之一，贮藏时间过长会导致种子种胚发育受到抑制、幼苗生长缓慢、植株发育不良[3]，从而影响作物、饲草、林木等种质资源的保育和创新，给农林生产带来严重的经济损失[4]。如室温贮藏10 a的沙葱（Allium mongolicum）种子其萌发率和萌发势随贮藏年限的增加逐渐降低，呼吸速率和各类抗氧化酶活性随贮藏年限的增加呈现出先升高后降低的趋势，其有效的贮藏期限为3 a[5]。随着贮藏年限的增加沙芥种子（Pugioniym cornutum）和斧形沙芥（Pugioniym dolabratum）种子可溶性糖和淀粉含量呈先上升后降低的趋势，其平均寿命为4 a和6 a[6]。

红砂（Reaumuria soongorica）是广泛分布在中国西北干旱荒漠地区的多年生小灌木[7]，具有较强的耐旱、耐盐碱等特性，对荒漠地区的生态修复发挥着重要作用[8]。作为典型的荒漠植被，其多以种子为繁殖材料。关于贮藏条件对红砂种子的影响，前人的研究主要集中在不同温度及湿度方面。高茜[9]报道，随着贮藏温度的变化，红砂种子SOD、POD活性逐渐降低，且在-8 ℃贮藏条件下能有效抑制种子衰老，保持种子活力。王鑫鑫等[10]研究发现，红砂种子在高温高湿环境条件下，其萌发指标和保护酶活性降低，内部代谢物质含量增加。然而目前，关于不同贮藏年限对红砂种子活力、生理特征及种胚显微结构影响等方面的研究尚未见报道。

本试验以室温贮藏0～4 a的红砂种子作为试验材料，研究红砂种子活力、生理特性及内部显微结构的变化，以期初步探索红砂种子在贮藏过程中的生理生化变化机制。本研究结果将为红砂种子采收、培育及种苗生产提供方法指导，并为红砂种子老化机理探索提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试种子分别于2017-2021年每年11月采收于甘肃省武威市红砂种源试验基地相同母株。每个年限的种子采收后均用14目筛子净种，室内阴干后置于自封袋中，室温保存。

1.2 测定指标与方法

1.2.1 种子萌发指标的测定 选取2017-2021年5个年限均匀饱满的红砂种子各100粒，并设置3次重复，共1 500粒（约2.1 g）种子。用10%的84消毒液消毒20 min后，用蒸馏水冲洗3次，并在蒸馏水中浸种24 h后，将种子置于垫有润湿纱布的发芽盒中。萌发试验在温度（25±1）  ℃，相对湿度35%的恒温恒湿培养箱中进行。萌发过程中每日16：00-18：00观察并统计种子发芽个数，同时称量补充已损失水分。种子发芽以露白为标准，萌发总天数为种子置培养箱当天至连续3 d不发芽截止的天数。待发芽结束后（第11 天），选取5个年限的正常种苗（每个重复随机选取10株幼苗进行测定）用方格纸测量芽长，并按以下公式计算萌发率、萌发势、发芽指数、活力指数[11-14]。

GP=n1/N×100%（1）

GE=n2/N×100%（2）

GI=∑（Gt/Dt）（3）

VI=GP×L（4）

其中：GP为萌发率，GE为萌发势，GI为发芽指数，VI为活力指数，n1为正常发芽的种子数，n2为单日发芽种子数出现高峰前的所有发芽种子数，N为供试种子总数，L为芽长（cm），Gt为第t天的发芽数，Dt为相应的发芽时间（d）。

1.2.2 种子含水量测定 本试验严格按照国际种子检验协会检验规程[15]，对每个年限贮藏后的红砂种子含水量进行测定。每个年限称取约  4.5 g（共67.5 g）籽粒饱满均一、无虫害的红砂种子，放入铝盒并进行称量，并设置3次重复。将供试铝盒盖全部开启后，迅速放入130 ℃的烘箱内，烘干2 h。到达预定时间后，盖好铝盒盖，迅速放入干燥器里冷却干燥后进行称量。

种子含水量计算公式为：种子含水量=  （M2-M1）/（M2-M3）×100%

其中，M1为铝盒及盖子和样品烘干后总质量（g），M2为铝盒及盖子和样品烘干前总质量（g），M3为铝盒及盖子的总质量（g）。

1.2.3 生理指标的测定 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性：SOD活性采用氮蓝四唑还原法[16]测定。称0.20 g吸胀的红砂种子放入预冷的研钵中，加入2 mL 0.05 μmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液研磨成匀浆，再用缓冲液定容至10 mL，在4 ℃条件下12 000 r/min离心20 min，以0.1 mL上清液（粗酶液）为A液，加B液（1.5 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液，0.3 mL 130 mmol/L甲硫氨酸溶液，0.3 mL 750 μmol/L氮蓝四唑溶液，0.3 mL 20 μmol/L核黄素溶液，0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2溶液，蒸馏水0.1 mL）测定SOD活性，2支对照管加样只需将A液换为蒸馏水即可，1支遮光处理，1支同测试管一起在25 ℃ 4 000 lx光照度下光还原15 min。以暗处理管为对照，采用酶标仪（spectra MAX 190，美国）在560 nm波长处测定吸光度值用以计算酶活性，每个年限设置4次生物学重复（各生理指标重复数相同）。

可溶性糖（soluble sugar，SS）含量：SS含量采用蒽酮-乙酸乙酯比色法[17]測定。称0.20 g吸胀的红砂种子放入预冷的研钵中，加入蒸馏水研磨成匀浆，并定容至10 mL，于沸水中提取30 min（提取两次），取0.5 mL于20 mL试管中，加蒸馏水1.5 mL，再加0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯溶液以及5 mL浓硫酸，并设空白对照（不加样液），采用酶标仪在630 nm波长处测定吸光度值。

可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量：SP含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[18]。称  0.20 g吸胀的红砂种子放入预冷的研钵中，加蒸馏水研磨并定容至10 mL，取3 mL匀浆离心，吸取0.5 mL上清液，加0.5 mL蒸馏水，5 mL考马斯亮蓝G-250试剂混匀，放置2 min后，采用酶标仪在595 nm波长处测定吸光度值。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量：MDA含量采用高俊凤[19]的方法测定。称0.20 g吸胀的红砂种子放入预冷的研钵中，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，研磨并定容至5 mL，3 000   r/min离心10 min，上清液即为样品提取液。取上清液1 mL，对照管加1 mL蒸馏水，分别加2 mL   0.6%硫代巴比妥酸溶液，混匀后置于沸水浴中煮15 min，冷却后离心取上清液，采用酶标仪分别在450 nm、532 nm和600 nm波长处测定吸光  度值。

1.2.4 解剖结构的观测 随机选取不同贮藏年限的种子各20粒，共100粒种子（约0.14 g），经FAA[无水乙醇∶37%甲醛∶冰乙酸=18∶1∶1（体积比）]固定48 h冷藏后，制作石蜡切片，植物番红染色液染色2 h，再将切片放入不同浓度梯度的酒精中脱色3～8 s，再用植物固绿染色液染色20 s后二次脱色，最后中性树胶封片[20]。NIKON E100显微镜对各年限红砂种子胚结构进行观察，NIKON DS-U3成像系统拍照。

1.3 数据处理

用EXCEL 2019软件进行萌发指标及生理指标的计算和制图，图表中数据均为“平均值±标准差”。利用SPSS 21.0软件中的单因素（One-way ANOVA）和Duncans法进行萌发指标及生理指标的方差分析和多重比较（α=0.05），   P<0.05代表差异显著。采用Pearson相关分析方法分析萌发指标和生理指标之间的关系。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏年限对红砂种子萌发特性的影响

由图1和表1可知，随贮藏年限的增加，红砂种子萌发指标均呈逐渐降低的趋势。在0～2 a的贮藏期内，种子萌发指标下降趋势较小，而在  3～4 a的贮藏期内，种子萌发指标下降趋势明显。其中贮藏2 a和3 a的种子萌发指标变化最大，贮藏4 a的种子萌发指标显著低于（P<0.05）0～3 a的种子。此外从萌发率曲线可以看出，贮藏0～2 a的种子萌发速率也大于3～4 a的种子。总体来看，室温贮藏1 a的红砂种子，其萌发效果  最佳。

2.2 不同贮藏年限对红砂种子含水量的影响

由图2可知，红砂种子含水量随贮藏年限的增加逐渐减小。当年采收的种子含水量最高，与贮藏1 a相比差异不显著（P>0.05），与2～4 a相比差异显著（P<0.05），贮藏2 a和3 a的种子含水量差异显著（P<0.05）且降幅最大为  21.76%。贮藏4 a的种子含水量最低，显著低于贮藏0～2 a的种子（P<0.05）。

2.3 不同贮藏年限对红砂种子超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

由图3可知，红砂种子SOD活性随贮藏年限的增加呈先增加后降低的趋势，至第4 年降至最低，仅为44.31 U/g。其中贮藏1 a的种子SOD活性最高，达到170.67 U/g，与其他各贮藏年限相比差异显著（P<0.05），贮藏1 a和2 a的种子SOD活性变化最大，降幅为37.35%。

2.4 不同贮藏年限对红砂种子内部代谢物质含量的影响

红砂种子可溶性糖（SS）和可溶性蛋白（SP）含量随着贮藏年限的增加都呈先增加后降低的趋势（图4-A，4-B），且均在贮藏1 a时达到峰值，分别为5.15 mg/g、4.37 mg/g，在贮藏4 a时降至最低，分别为2.82 mg/g、2.38 mg/g，与其他年限相比差异显著（P<0.05）。其中SS含量在贮藏3 a和4 a间降幅最大为31.88%，SP含量在贮藏1 a和2 a间降幅最大为24.54%。红砂种子MDA含量随着贮藏年限的增加呈逐渐升高的趋势（图4-C），当年采收的种子MDA含量最低，仅为3.97 μmol/g，显著低于其他年限（P<0.05），贮藏4 a种子MDA含量最高，达到14.28   μmol/g，显著高于其他贮藏年限  （P<0.05）。其中贮藏1 a和2 a的种子MDA含量增幅最大，为  96.30%。

2.5 贮藏年限对红砂种子胚解剖结构的影响

由图5可以看出，室温贮藏条件下，各年限种子随着贮藏年限的增加，种子胚与种皮之间的间隙逐渐增大。

贮藏2 a的种子胚表层薄壁细胞结构被破坏，种皮薄壁细胞出现破裂现象而且界限不明显（图5-C）；贮藏3～4 a的种子胚，其子叶逐渐减小（图5-D），薄壁细胞排列散乱，种皮薄壁细胞厚度减小（图5-E），染色剂着色效果较差，但种子胚的薄壁细胞染色程度却进一步加深。

2.6 各贮藏年限红砂种子生理指标与萌发指标的相关性

由表2可知，不同贮藏年限的红砂种子MDA含量与各萌发指标呈极显著负相关（P<  0.05）；可溶性糖含量与萌发势呈负相关，与萌发率、发芽指数、芽长和活力指数呈正相关，相关性不显著；可溶性蛋白含量与各发芽指标均呈正相关，相关性不显著；各萌发指标（萌发势除外）与SOD活性呈负相关，相关性不显著；含水量与各萌发指标均呈极显著正相关（P<0.05）。

3 讨  论

3.1 不同贮藏年限红砂种子的萌发特性

种子寿命和活力反映了种子质量及其综合特性，高活力种子拥有在恶劣环境条件下正常萌发和出苗的能力[21]。芽长、萌发率和萌发势等是种子活力状况评价的重要指标，种子活力越高则其抗逆能力越强[22]。本研究发现，红砂种子萌发指标随贮藏年限的增加逐渐降低，其在贮藏的0～  2 a内均能正常萌发，萌发指标也都比较高。但在贮藏第3年时，由于种子内部营养物质的损失，其萌发指标均有大幅度的下降，这与老芒麦 （Elymus sibiricus） 和燕麦（Avena sativa） 种子的贮藏研究得出的结果一致[23-24]。试验表明，室温贮藏条件下，红砂种子活力变化的节点在贮藏第  2～3 年，考虑到维持种子高活力的因素，红砂种子安全的贮藏年限应保持在2 a之内。

3.2 不同贮藏年限红砂种子SOD活性的变化

SOD是抗氧化系统中重要的保护酶，可以通过歧化作用清除种子细胞内积累的活性氧自由基，种子SOD活性越高则其抗氧化能力越强，种子活力也越高[25]。本研究发现，贮藏0～1 a的红砂种子SOD活性较高，说明种子活力较高，抗逆能力强。贮藏第3年活性氧自由基迅速积累，SOD活性急剧下降，种子活力随之减弱，这与常海文[26]对贮藏3 a的沙葱（Allium mongolicum）种子SOD活性的研究得出的结果一致。笔者推测，种子贮藏初期，活性氧自由基增加，为清除活性氧自由基维持代谢平衡SOD活性升高，但随着贮藏年限的延长，活性氧自由基进一步积累，代谢平衡被破坏，SOD活性持续降低。

3.3 不同貯藏年限红砂种子内部相关物质含量的变化

首先，种子含水量与其贮藏时间密切相关，种子贮藏过程中含水量的变化会对其活力及耐贮性产生较大影响[27]。本研究发现，随着贮藏年限的增加红砂种子的水分逐渐减少，种子含水量与其萌发指标呈正相关，这与辛慧慧[28]对不同贮藏年限红豆草（Onobrychis viciaefolia）种子含水量对萌发指标的研究结果类似。由此得出，室温贮藏条件下，红砂种子在0～2 a的贮藏期内含水量不会影响其生活力，种用价值未受影响。

其次，贮藏1 a的种子其呼吸速率加快，种子内各类大分子物质转化为可溶性糖[29]，其含量较当年采收有所增加，但随着贮藏年限的延长，种子内部生理生化反应持续消耗可溶性糖，其含量开始下降，这与披碱草（Elymus nutans）和蓝茎冰草（Agropyrom smithii）种子可溶性糖含量随贮藏时间的增加先升高后降低的情况一致[30-31]。可溶性蛋白为植物的生长发育提供了氮素营养，在老化种子内蛋白质发生羰基化作用使蛋白质功能特性消失，影响正常的糖酵解、三羧酸循环等生化过程[32]。有研究表明，苜蓿（Medicago sative）种子、沙芥（Pugionium cornutum）种子和沙葱（Allium mongolicum）种子在贮藏过程中，其可溶性糖含量均呈现出先升高后降低的趋势[33-35]。本研究发现，贮藏1 a的红砂种子可溶性蛋白含量最高，但从第3年起其含量开始下降，贮藏第4年时降至最低。由此推测红砂种子在贮藏后期，其内部物质能量代谢受到影响，薄壁细胞逐渐被破坏，导致细胞无法合成新的蛋白质，造成可溶性蛋白含量降低，种子活力下降。

再次，MDA是植物膜脂过氧化的最主要产物之一，可以反映种子生物膜系统受毒害的程度[36]。方骄阳等[37]研究得出，随着贮藏时间的变化香椿[Toona sinensis （A.Juss）Rem]种子内MDA含量逐渐增加，这与本试验结果一致。笔者发现室温贮藏条件下，随着贮藏年限的增加MDA含量逐渐增加。尤其在贮藏2 a和贮藏3 a间的增加幅度最为明显。因此推测，贮藏第3年时种子老化程度加剧，脂膜过氧化物增加，种子内环境进一步恶化，MDA迅速增加。

3.4 不同贮藏年限红砂种子种胚显微结构特征

种子胚细胞结构的完整性与其贮藏时间密切相关[38]，种胚细胞的畸变和细胞膜结构的损伤将导致种子活力下降[39]。本研究发现，各贮藏年限的红砂种子，在种子胚的薄壁细胞结构及染色液着色情况上均有较大差异。在贮藏0～1 a时，种子胚与种皮间的间隙较小，二者薄壁细胞排列紧密，膜结构比较完整，但随着贮藏年限的增加，胚外层薄壁细胞被损害，染色程度加深，这些现象与红砂种子的SOD活性、MDA含量密切相关。在贮藏初期，种子内部抗氧化酶活性较高，胚部细胞受损伤程度小，细胞膜结构完整。贮藏后期， MDA含量增高，细胞受毒害程度加剧，细胞膜结构遭到破坏，薄壁细胞破裂，种子活力降低。胚的薄壁细胞染色逐渐加深的原因则是，随着种子贮藏年限的增加，其木质化程度越来越高[40]，因为番红能将细胞内的木质素染成红色，故胚的薄壁细胞呈现出了着色逐渐加深的现象。同时笔者也发现贮藏年限为3～4 a的红砂种子，其含水量已经达到超干状态，种子因吸胀损伤严重而出现了子叶逐渐缩小的情况。

4 结  论

在室温贮藏条件下，红砂种子活力变化的节点在2～3 a之间，贮藏4 a以上的种子已基本丧失种用价值。采收后贮藏1 a的种子可溶性糖和蛋白含量最高，细胞膜及细胞器结构完整。在红砂的育种和栽培过程中，建议以贮藏1 a的种子为播种材料。

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Effects of Different Storage Years on Physiological Characteristics and Embryo Structure of Reaumuria soongorica Seeds

Abstract

In this study， Reaumuria soongorica seeds stored at room temperature for 0-4 a were used as experimental materials， the germination index， physiological index and embryo microstructure of Reaumuria soongorica seeds with different storage years were measured to explore the changes in seed vigor， physiology and microstructure during storage and aging. The results showed that the bud length， germination rate， germination potential， germination index， vigor index and water content of Reaumuria songarica seeds decreased gradually with the increasing storage years. The activity of superoxide dismutase （SOD）， the contents of soluble sugar （SS） and soluble protein （SP） increased and then decreased， while the content of malondialdehyde （MDA） increased gradually. The germination index of Reaumuria songarica seeds was negatively correlated with MDA content （P<0.05）， and positively correlated with SS and SP. Seeds harvested in the current year， had closely arranged embryo cells， whereas seeds stored of 3-4 years exhibited disordered embryo cell arrangement， the degree of lignification deepened and the colouring effect was obvious， and the phenomenon of gradual shrinkage with cotyledons was also observed. In conclusion， the water content， MDA and SP content of Reaumuria songarica seeds can accurately reflect their viability， and the node of seeds vigor change were between 2-3 a. In the production， it is recommended to select seeds stored at room temperature for 1 year post-harvest as sowing materials. The results of this experiment provide a theoretical for the vigor repair and safe storage of Reaumuria songarica seeds in the future.

Key words Reaumuria soongorica seeds; Storage life; Seed vigor; Physiological indicators; Microstructure of seed embryo