西藏油桃褐腐病菌生物学特性测定及室内药剂筛选

孙晨曦 毛维兴 相栋 徐秉良 张树武

摘 要 旨在明确西藏油桃上褐腐病菌（Monilia yunnanensis）的生物学特性及6种杀菌剂对其菌落生长的室内毒力。通过“菌落生长速率法”评价不同培养基成分温度、光照、pH及杀菌剂对M.yunnanensis菌落生长的影响。结果表明，在固体培养基上培养7 d后，M.yunnanensis最适生长碳源为淀粉，其生长速率为  0.696 cm/d，其次是乳糖和蔗糖，其生长速率分别为0.558和0.417 cm/d，在葡萄糖和山梨醇上的生长速率为0.343和0.328 cm/d，但在甘露醇培养基上具有显著的抑制作用；最适生长氮源为苯丙氨酸，生长速率为0.374 cm/d，蛋氨酸、硝酸铵及硝酸钠次之，其生长速率分别为0.290、0.248和0.246 cm/d，但是硫酸铵和尿素对其生长具有抑制作用；最适光照条件为全黑暗，其菌丝生长速率为0.721 cm/d，较其他光照条件具有显著性差异；最适温度20～25 ℃，但当温度高于40 ℃则不能正常生长；最适pH为6～8。室内毒力测定结果表明，6种杀菌剂对西藏油桃褐腐病菌生长均具有不同的抑制效果，其中丁子香酚和戊唑醇的抑菌效果最佳，其EC50值分别为0.032和0.043  μg/mL。

关键词 西藏；油桃褐腐病；生物学特性；杀菌剂；生长速率

西藏自治区位于青藏高原西南部，是中国气候资源最多样与果树资源最为丰富的区域之一［1］。油桃是西藏主要的水果种类之一，截止2016年，桃树栽培面积和产量分别占全自治区的18%和16%，居水果类第二位［2］。西藏油桃具有口感香甜、肉质细脆、耐贮运及耐长途运输，且富含蛋白质、粗纤维、糖及矿物质等多种人体所必需的物质， 被称为“天下第一果”［3］，但是随着油桃树栽培面积的不断增加，油桃褐腐病的发生愈来愈严重，对西藏地区油桃产业的发展造成了严重影响。桃褐腐病是一种能严重危害核果和仁果类水果生产的真菌性病害［4］，是桃树上发生的一种常见病害［5］，并且其可在桃树整个生长期进行危害，不仅造成花腐、果腐和枝条溃疡等症状，导致果树产量和质量下降，还可引起储藏期果实腐烂，造成严重的经济损失［6］，严重时还对翌年桃树成花坐果不利，对桃树造成毁灭性损失［7］。

目前，世界上已报道的引起果树褐腐病的链核盘菌属亲缘关系较近的有6个种［8］，中国的褐腐病菌種群与欧美种群有所不同，目前中国已确定的种有4个，主要3个种为Monilinia fructicola、Monilia mumecola和Monilia  yunnanensis［9-10］，其中M.yunnanensis主要分布于云南、北京、陕西和沈阳等地区［4，9］，植物病害生物防治课题组前期研究发现引起了西藏油桃褐腐病的病原为M.yunnanensis，首次报道了其造成西藏油桃褐腐病［11］，但是关于油桃褐腐菌生物学特性的研究较少。同时，目前关于桃褐腐病的防治仍以化学手段为主，但果园的喷药量没有一定的规范标准，喷施药物量大且种类杂，田间防效参差不齐［12］，导致了桃表面农药残留超标、病菌对多种药物产生抗性、危害人体健康的同时还对环境造成了污染［13］。因此，筛选出低毒高效的化学药剂和安全高效的植物源药剂是防治该病害的一种重要方法。目前有关西藏地区油桃褐腐菌生物学特性及其药剂筛选尚未报道。因此，本试验开展了西藏地区油桃褐腐病菌的生物学特性测定，以及其植物源和低毒高效化学药剂的筛选，旨在明确西藏地区油桃褐腐病菌的生物学特性，并筛选获得防效较好的药剂，为西藏地区油桃褐腐病菌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

以课题组前期分离自西藏林芝市巴宜区，林芝镇圣域公司示范园区油桃褐腐病病害标本的病原菌Monilia yunnanensis作为供试材料。

1.2 供试培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖  20 g、琼脂15 g、蒸馏水1  000 mL。

查氏（Czapek）培养基：KNO3 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、KCL 0.5 g、KH2PO4 1 g、琼脂15 g、蔗糖30 g、蒸馏水1  000 mL。

1.3 供试药剂

药剂筛选中供试药剂见表1。

1.4 试验方法

1.4.1 Monilia yunnanensis活化与培养 将  4 ℃低温保存于斜面培养基上的油桃褐腐病菌接种于PDA培养基，并置于温度为25 ℃，光照时间为16/8 h的培养箱中进行活化培养，培养3 d后备用。

1.4.2 不同碳源对Monilia yunnanensis生长的影响 试验以查氏培养基作为供试培养基，供试碳源选用等质量的葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉和山梨醇代替查氏培养基中的蔗糖，测定不同碳源对油桃褐腐病菌生长的影响。试验以不加碳源的查氏培养基作为对照，每个处理和对照分别重复6次。待接种培养后，每隔1 d采用“十字交叉法”测定M.yunnanensis的菌落直径，并计算其生长速率。

1.4.3 不同氮源对Monilia yunnanensis生长的影响 试验以查氏培养基作为供试培养基，供试氮源选用质量相等的尿素、苯丙氨酸、硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵和蛋氨酸替代查氏培养基中的NaNO3，测定不同氮源对油桃褐腐病菌生长的影响。试验以不加氮源的查氏培养基作为对照培养基，每个处理和对照分别重复6次。待接种培养后，每隔1 d采用“十字交叉法”测定M.yunnanensis菌落直径，并计算其生长速率。

1.4.4 不同温度对Monilia yunnanensis生长的影响 试验以PDA培养基作为供试培养基，供试温度条件选用5 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃，测定不同温度对油桃褐腐病菌生长的影响。试验每个处理和对照分别重复6次。待接种培养后，每隔1 d采用“十字交叉法”测定M.yunnanensis菌落直径，并计算其生长  速率。

1.4.5 不同pH对Monilia yunnanensis生长的影响 试验以PDA培养基作为供试培养基，供试pH条件分别设为4、5、6、7、8和9，测定不同pH对油桃褐腐病菌生长的影响。试验每个处理和对照分别重复6次。待接种培养后，每隔1 d采用“十字交叉法”测定M.yunnanensis的菌落直径，并计算其生长速率。

1.4.6 不同光照对Monilia yunnanensis生长的影响 试验以PDA培养基作为供试培养基，供试光照处理条件分别设为25 ℃持续光照24 h、  25 ℃持续黑暗24 h和25 ℃光照/黑暗交替处理 （12/12 h）。试验每个处理和对照分别重复6次。待接种培养后，每隔1 d采用“十字交叉法”测定M.yunnanensis菌落直径，并计算其生长速率。

1.4.7 6种杀菌剂对Monilia yunnanensis的室内毒力测定 试验供试药剂香芹酚的浓度梯度设置为1、2、4、8、16 mg/L；乙蒜素的浓度梯度设置为1、2、4、8、16 mg/L；吡唑醚菌酯的浓度梯度设置为0.15、0.3、0.6、1.2、2.4 mg/L；戊唑醇的浓度梯度设置为0.01、0.02、0.04、0.08、0.1 mg/L；丁子香酚的浓度梯度設置为0.02、0.03、0.04、  0.05、0.06 mg/L；甲基硫菌灵的浓度梯度设置为  0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/L。将不同农药分别配制成10 mL其浓度梯度10倍的浓缩液，然后将浓缩液分别加入到90 mL PDA中，制成相应浓度梯度的含药培养基。以加入10 mL无菌水于90 mL PDA中制成培养基作为对照培养基。然后，利用经灭菌的直径为0.5 cm打孔器打取活化3 d的M.yunnanensis菌饼，分别接种于各含药培养基中央。试验以PDA培养基作为对照，每个处理重复6次，并置于温度为25 ℃，光照时间为16/8 h的温培养箱中培养。待培养7 d后，采用“十字交叉法”测定不同含药培养基上菌落直径，并计算不同药剂对M.yunnanensis菌落生长抑制率。以浓度对数值（x）与抑制率几率值（y）之间的线性回归关系求出毒力回归方程和EC50值［14］。参考纪兆林等［12］文献评价杀菌剂毒力的方法，根据不同药剂EC50值评价其杀菌剂毒力：EC50＜0.01 μg/mL，很强；EC50为0.01～0.1 μg/mL，强；EC50为 0.1～1.0 μg/mL，较强；EC50为1.0～5.0 μg/mL，中等；EC50为5.0～10.0 μg/mL，较弱；EC50＞10.0 μg/mL，弱。

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2016软件进行数据处理与图表制作，并采用SPSS 25.0软件进行Probit分析与卡方检验。采用单因素方差分析各处理平均数的差异及其差异显著性检验（Duncan新复极差法）。

2 结果与分析

2.1 不同碳源对Monilia yunnanensis生长的  影响

结果发现，培养7 d后，以葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、可溶性淀粉和山梨醇等作为唯一碳源培养的M.yunnanensis生长速率具有不同程度差异。与对照相比，淀粉、乳糖和蔗糖对M.yunnanensis菌落的生长具有显著的促进作用，其中以淀粉作为唯一碳源的培养基对其菌落的生长促进作用最显著，其生长速率为0.696 cm/d，而以葡萄糖和山梨醇作为唯一碳源的培养基促进作用则不显著，其生长速率分别为0.343 cm/d和  0.328 cm/d。另外，当以甘露醇作为唯一碳源的培养基对其菌落生长具有显著的抑制作用，其生长速率为0.235 cm/d（图1）。

2.2 不同氮源对Monilia yunnanensis生长的影响

与对照相比，培养7 d后，以苯丙氨酸、蛋氨酸、硝酸铵、硝酸钠作为唯一氮源的培养基对M.yunnanensis菌落生长具有明显的促进作用，其中苯丙氨酸促进作用显著高于蛋氨酸、硝酸铵和硝酸钠，其生长速率为0.374 cm/d。同时，与对照相比，硫酸铵和尿素对M.yunnanensis菌落的生长具有显著抑制作用，且尿素抑制作用最强，使得菌落不能正常生长，其次为为硫酸铵，其生长速率为0.045 cm/d（图2）。

2.3 不同温度对Monilia yunnanensis生长的影响

结果表明，M.yunnanensis菌落生长速率随着温度（5～40 ℃）的升高呈先增加后降低的趋势，并且不同温度对其生长速率的影响存在显著差异。在5～20 ℃的条件下，随着温度的升高其生长速率逐渐上升， 培养7 d后其在5 ℃、10 ℃、15 ℃和20 ℃时生长速率分别为0.168、0.391、  0.686 和1.071 cm/d，尤其在20 ℃条件下菌落生长速率最大，并且与其它温度相比差异显著。然而，在25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃条件下，其生长速率随着温度的升高逐渐降低，生长速率分别为0.986、0.843、0.631、0.419和0 cm/d  （图3）。

2.4 不同光照对Monilia yunnanensis生长的影响

结果表明，不同光照条件对M.yunnanensis菌落的生长速率具有不同程度的影响，待培养7 d后，在全黑暗条件下M.yunnanensis菌落生长最快，其生长速率为0.721 cm/d，与全光照和光照交替条件下菌落生长速率相比，全黑暗条件下其菌落生长速率显著高于全光照和光照交替条件，分别增长了0.116和0.059 cm/d。然而，全光照条件下M.yunnanensis菌落生长速率较低，仅为0.605 cm/d。从表2可以看出，每天的光照条件随着黑暗时间的增长，其菌落生长速率增高。

2.5 不同pH对Monilia yunnanensis生长的影响

结果表明，不同pH对M.yunnanensis菌落的生长速率具有不同程度的影响。培养7 d后，当pH为6～8时其菌落生长速度较快，尤其当pH为6时最佳为0.982 cm/d。然而，当pH=5和9时其生长速率较低，分别为0.713和0.681 cm/d（表3）。

2.6 不同杀菌剂对Monilia yunnanensis的室内毒力测定

毒力测定结果表明，生物源杀菌剂丁子香酚对M.yunnanensis菌落生长的抑制作用最强，其EC50为0.032 μg/mL。其次为化学杀菌剂戊唑醇，其EC50为0.043 μg/mL。甲基硫菌灵和吡唑醚菌酯的抑菌能力为较强，其EC50分别为0.294和0.467 μg/mL。香芹酚抑菌能力较弱，其EC50为7.84 μg/mL。乙蒜素的抑菌能力最弱，其EC50为17.944 μg/mL。

根据其毒力回归方程斜率可以看出，M.yunnanensis对供试6种杀菌剂较为敏感性，其中对甲基硫菌灵的敏感性最高，其斜率为3.734，其余杀菌剂的斜率为1.029～2.409。同时，试验中6种杀菌剂对M.yunnanensis生长的抑制作用與其浓度呈正相关（表4）。

3 讨  论

前期对果实褐腐病菌的研究主要集中在樱桃［15］、桃［16］、苹果［17］等果实上，有关油桃褐腐菌的报道与研究相对较少，而西藏油桃褐腐菌生物学特性的相关研究还未见报道。本试验发现Monilia yunnanensis在固体选择培养基上最适碳源为淀粉，这与纪兆林等［18］对不同产区的桃褐腐病菌的生物学特性进行探究，发现其菌丝生长的最适生长碳源为淀粉结果一致。同时，本试验发现Monilia yunnanensis在固体培养基上最适生长氮源为苯丙氨酸，在温度为5～35 ℃的条件下均能生长，其生长特性整体呈现出先升高再降低的趋势，高于40 ℃则不能生长，其最适生长温度为20～25 ℃，这与宋丹丹等［19］研究结果基本一致，其表明蟠桃褐腐病菌Monilinia  fructicola菌丝的最适生长温度范围20～28 ℃，但是高于36 ℃时则不能正常生长。与郝晓娟等［20］研究发现的欧李褐腐病菌Monilinia  fructicola菌丝在  7～27 ℃均能正常生长稍有差异，其原因可能与病原菌种类和菌株分离来源的地域气候条件有关。Monilia yunnanensis最适的光照条件为全黑暗，这与刘志恒等［15］研究发现大樱桃褐腐病菌Monilinia  fructigena在光照、光暗交替、黑暗3种条件下菌丝都能正常生长，但在黑暗条件下菌丝生长稍快的结果一致。Monilia yunnanensis最适生长pH范围在6～8之间，且在中性及弱酸碱性条件下生长速度稍快，这与郝晓娟等［20］发现在pH 6～8时，适宜于欧李褐腐病菌孢子萌发的结果基本一致。

另外，本试验发现丁子香酚和戊唑醇对Monilia yunnanensis菌落生长抑制作用效果最佳，但甲基硫菌灵对Monilia yunnanensis菌落生长抑制作用效果低于戊唑醇，这可能与Monilia yunnanensis对DMI类杀菌剂和苯并咪唑类药剂产生抗性有关［21-22］。丁子香酚作为一种生物源药剂，不仅对Monilia yunnanensis菌的生长抑制效果最好，并且在自然环境中极易分解转化，对环境友好，对人畜安全，是一种理想的杀菌剂。本研究所用杀菌剂为不同剂型的制剂，相较于原药有更好的田间应用价值，但制剂不同的助剂和剂型都可能影响测定结果，其影响有待进一步研究。本试验为几种杀菌剂对Monilia yunnanensis的室内毒力测定，而在田间会受到气候条件等多种不可控因素的影响，因此在田间的应用效果还需要通过田间试验进一步探究。

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Determination of Biological Characteristics of Nectarine Brown Rot Fungus in Xizang and Indoor Pharmacy Screening

Abstract In order to clarify the biological characteristics of the pathogen of nectarine brown rot （Monilia yunnanensis） in Xizang， and determine the toxic effect of six fungicides on its colony growth， we evaluated the effect of different composition of culture media and conditions as well as fungicides on the M.yunnanensis colony growth by the method of colony growth rate.The results showed that the most suitable carbon source for M.yunnanensis growth was starch with a growth rate of 0.696 cm/d on the solid medium at 7 days after incubation， followed by lactose， sucrose， glucose and sorbitol， and with the growth rates of 0.558， 0.417， 0.343 and 0.328 cm/d， respectively. In contrast， a significant inhibitory effect was observed on the mannitol medium; the most suitable nitrogen source was phenylalanine， and the growth rate was 0.374 cm/d， followed by methionine， ammonium nitrate and sodium nitrate， and the growth rates were 0.290， 0.248 and 0.246 cm/d， respectively. However， the ammonium sulfate and urea had significant inhibitory effect on M.yunnanensis growth; the most suitable light condition was darkness， and the colony growth rate was 0.721 cm/d， which was significantly different from other light conditions; the optimum temperature was 20 to 25 ℃， whereas the temperature cannot grow normally was higher than 40 ℃; the optimum pH was 6-8. In addition， The test results also showed that the six fungicides had different inhibitory effects on the growth of   M.yunnanensis. The eugenol and tebuconazole exhibited the best antifungal effect， and their EC50 values were 0.032  and 0.043  μg/mL， respectively.

Key words Xizang; Nectarine brown rot; Biological characteristics; Fungicides; Growth rate