甘肃省胡萝卜根结线虫病病原鉴定

安丽婷 石明明 倪春辉 刘永刚 魏雪娟 乔万强 李惠霞

摘 要 为了明确根结线虫种类，采用形态学和分子生物学方法，对甘肃省临洮县胡萝卜上的根结线虫进行鉴定，并测定其致病性。结果表明，该群体雌虫虫体梨形或柠檬形，乳白色，口针粗壮，中食道球近圆形。雌虫会阴花纹呈卵圆形，背弓较平缓，肛门处有刻点。雄虫虫体细长，尾部钝圆，交合刺针状，成对。2龄幼虫虫体细长，呈蠕虫形，唇区无明显缢缩，口针发达，口针基部球小而圆，尾部透明区明显，尾尖钝圆。利用特异性引物Mh-R/Mh-F扩增得到大小为462 bp的特异性片段，与北方根结线虫（Meloidogyne hapla）一致。基于根结线虫属rDNA ITS和28S-rDNA D2D3区序列构建系统发育树，发现该群体均与北方根结线虫序列聚为一支。将该线虫接种胡萝卜，其症状与田间发病症状一致，35 d后分离线虫，其形态特征与北方根结线虫相符。综上，形态学特征结合分子生物学方法，将该病原鉴定为北方根结线虫（M.hapla），这是甘肃省首次报道北方根结线虫危害胡萝卜类蔬菜作物。

关键词 胡萝卜；北方根结线虫；形态学特征；分子生物学；致病性；鉴定

胡萝卜（Daucus  carota var. sativa Hoffm.）属伞形科胡萝卜属2 a生草本植物，在世界各地广泛种植，为全球性十大蔬菜之一[1]，含有丰富的类胡萝卜素等多种植物活性物质，具有抗癌、抗菌和血清生成的作用[2]。中国胡萝卜种植面积约占世界总面积的40%，种植面积和总产量均居世界第一[3]。甘肃省是中国重要的胡萝卜产区，全省胡萝卜种植面积达到2.355万hm2，产量达69.5万t，近年来，定西市临洮县胡萝卜种植面积约  0.3万 hm2，是甘肃省胡萝卜种植大县之一，胡萝卜产业已成为农民致富的新增长点[3]。

根结线虫（Meloidogyne spp.）寄主范围广泛，致病性强，是对中国农业生产影响最大的一类植物病原线虫[4]。对经济造成严重损失的常见种类主要是南方根结线虫（M. incongnita）、爪哇根结线虫（M. javanica）、花生根结线虫（M. arenaria）和北方根结线虫（M. hapla）等4种[5-6]。据统计，中国蔬菜种植面积约1 100万hm2，因根结线虫为害造成减产约为30%，严重时甚至绝收，每年造成的经济损失达5亿美元[7]。在北方，主要以南方根结线虫危害保护地蔬菜，甘肃省尚未见北方根结线虫危害蔬菜的报道。2020年，在甘肃省临洮县窑店镇发现露地胡萝卜发生根结线虫病，本研究拟通过病样采集，利用形态学特征和分子生物学技术对其进行鉴定，以确定根结线虫种类，为该病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

2020年10月，在甘肃省定西市临洮县窑店镇（N 35°2′99″，E 103°8′59″）胡萝卜病田，采集具有典型症状的病株，带回实验室分离。

1.2 胡萝卜根结线虫病病原种类鉴定

1.2.1 根结线虫雌虫会阴花纹的制作与形态观察 将胡萝卜病株根系洗净，置于体视显微镜下，用眼科手术刀将根结表皮切开，用毛刷或镊子将乳白色的球状物（即为根结线虫雌虫）挑出，收集20头，备用。载玻片上滴一滴0.9% NaCl溶液，挑取一头，观察形态特征并拍照，参照谢辉[8]的方法测量雌虫的形态特征值。

会阴花纹的制作与观察[7]：将雌虫置于滴有45% 乳酸的载玻片上，用手术刀切去雌虫的颈，然后轻轻挤压虫体排出内含物，用手术刀将含有会阴花纹的虫体后部切下，修整成平整的正方形，放置于载玻片上的甘油滴中，用毛针拨平铺正，盖上盖玻片，制成临时玻片，用显微镜观察雌虫会阴花纹并拍照。

1.2.2 根结线虫2龄幼虫的收集与形态观察 在体视显微镜下用灭菌的眼科手术刀切开较大的根结，收集单个卵囊。将其置于盛有蒸馏水的培养皿中，28 ℃恒温培养箱孵化。2～3 d后，在体视显微镜下观察孵出2龄幼虫[9]，挑取20条，  备用。

载玻片上滴加蒸馏水，挑取2龄幼虫，酒精灯上加热，隔2～3秒在显微镜下观察虫体，若弯曲的线虫虫体突然伸直，則表明线虫已死亡，停止加热。热杀死的线虫立即加一滴TAF固定液（制作比例：三乙醇胺2 mL、福尔马林7 mL、蒸馏水91 mL）固定，制作临时玻片。以水作为浮载剂，将固定好的线虫挑入，盖上盖玻片[7]，在显微镜下观察线虫形态并拍照，参照谢辉[8]的方法，进行形态学观察和体值测量。

1.2.3 分子生物学鉴定 根结线虫DNA的提取：参照王江玲等[10]和王曦茁等[11]的方法稍作改进。将孵出的2龄幼虫清洗消毒后，挑取单条至盛有10 mL ddH2O的离心管中，反复冲洗2～3次，随后转移到含有10 μL线虫裂解液的PCR管中。用灭菌解剖刀将线虫切成数节，离心  2 min后，加1 mg/mL的蛋白酶K 1 μL。将裂解后的线虫置于PCR仪65 ℃恒育1 h，以降解蛋白质，然后95 ℃恒温10 min，得到线虫DNA粗提取液。

PCR扩增：采用线虫ITS-rDNA通用引物TW81/AB28[12]、28S-rDNA通用引物D2A/D3B[13]及北方根结线虫特异性引物Mh-F（5′-CGAATAGTCTCAACGTTTATC-3′）/Mh-R（5′-ATGTGACAGCGAAAAGAATT-3′）[14]进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL，包括DNA模板3 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1  μL，ddH2O 7.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃变性3 min，95 ℃变性30 s，退火温度（55 ℃、55 ℃、52 ℃）退火30 s，  72 ℃延伸1 min，循环34次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR扩增产物5 μL经1.2%的琼脂糖凝胶100 V电泳30 min进行检测， 最后在凝胶成像分析系统中观测拍照[15]。

扩增产物测序及数据分析：参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，回收ITS序列和28S rDNA D2D3区的扩增产物。将回收产物与pMDTM 18-T载体连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后均匀涂布于LB-氨苄青霉素固体培养基上，用灭菌牙签挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，获得阳性克隆后委托擎科生物技术有限公司（北京）测序。测序结果在NCBI中进行BLAST比对分析，下载置信度较高的序列，采用Clustal W对其和近源种进行比对分析，通过Gbock 0.91b选择保守区域后用MeModeltest version 2.3筛选最佳模型，最后用MrBayes构建系统发育树[15-17]。分别以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）（登录号 X03680）和禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）（登录号 LT159825）为ITS和28S序列系统发育树的外群。

1.2.4 致病性测定 将健康胡萝卜种植于16×20 cm的塑料盆中，每盆一株，共10株，放置于  25～28 ℃的温室中，光暗交替培养（14L/10D）。2周后，8株胡萝卜上接种北方根结线虫临洮群体的卵和2龄幼虫混合液2 500条，2株未接种，作为对照。25～28 ℃温室中培养，连续观察植株发病情况。待植株发病后，从根上分离线虫，观察其形态是否与接种的线虫群体一致。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜根结线虫病危害症状

胡萝卜感染根结线虫后，初期地上部症状不明显，后期发病重时地上部表现为植株矮小、叶片黄化萎蔫，发病植株常呈块状分布，造成缺苗断梗。挖出肉质根，可观察到根部有大量须根和毛细根，主根偶有分叉。其上有球形或圆锥状、大小不等的瘤状物，即为根结（图1-A）。根结初期为白色，表面光滑（图1-B），后期逐渐变为褐色并开始腐烂。剖开根结，可观察到半透明或乳白色、针头大小的雌成虫。

2.2 根结线虫胡萝卜群体形态学特征

根结线虫雌虫形态测量值见表1。雌虫虫体为梨形或柠檬形（图2-A），乳白色，虫体前端突出如颈，后端椭圆形，口针强壮，中食道球发达，近圆形（图2-B）。雌虫会阴花纹呈卵圆形，背弓略平，有些群体刻线明显，有些不明显（图2-C），肛门处有刻点。上述会阴花纹均为北方根结线虫的典型特征。

该线虫群体雄虫形态测量值见表1。雄虫虫体蠕虫形（图3-A），口针粗壮（图3-B）。尾部钝圆，交合刺针状，成对（图3-C）。

胡萝卜上根结线虫2龄幼虫形态测量值见表1。线虫虫体细长，头部钝圆光滑，尾部尖细，（图3-D）唇区无明显缢缩，口针发达（图3-E），口针基部球明显，呈圆形。尾部透明区清晰（图3-F），这些特征均与北方根结线虫2龄幼虫特征相符。因此，初步将该线虫群体鉴定为北方根结线虫（M. hapla）。

2.3 分子生物学鉴定结果

利用通用引物扩增得到ITS和28S片段，大小分别为577 bp和762 bp，ITS序列（GenBank登录号OM854803）与北方根结线蟲（GenBank登录号MT249021、LC030361等）相似度为  98.37%～99.82%，28S序列（GenBank登录号OM401656）与北方根结线虫（GenBank登录号KJ598136、MN475814等）相似度为99.44%～99.87%。基于GTR+I+G模型构建ITS和28S系统发育树显示，该根结线虫ITS序列与北方根结线虫序列聚为一支，置信度为100%，与其他根结线虫序列可明显区分（图4）；28S序列与北方根结线虫聚为一支，置信度达100%，与其他根结线虫序列可明显区分开（图5）。

利用北方根结线虫特异性引物Mh-F/Mh-R扩增得到大小为462 bp的片段（图6），而对照没有扩增出特异条带，进一步表明所测样本为北方根结线虫（M. hapla）。

2.4 致病性测定

株根部均有明显的根结形成，与田间观察到的症状一致，2株对照均未发现根结。从发病植株分离根结线虫，观察发现其形态特征与接种线虫一致，表明侵染胡萝卜的病原是北方根结线虫。

3 讨论与结论

本研究对胡萝卜根结线虫病病株进行病原分离，通过形态学鉴定、分子生物学鉴定和致病性测定，确定引起甘肃省临洮县胡萝卜根结线虫病的病原为北方根结线虫（M.hapla）。北方根结线虫是冷凉区作物上最主要的植物病原线虫[16]。其寄主范围广泛，致病性强，可侵染蔬菜、烟草、花生、豆类等[17]多种作物，2020年，Li等[18]在甘肃省渭源县党参上首次发现北方根结线虫。目前，国内报道的引起胡萝卜根结线虫病的病原有南方根结线虫[19]、花生根结线虫和北方根结线虫[20-21]。2010年，苏定昌等[21]报道花生根结线虫和北方根结线虫引起胡萝卜根结线虫病，但未对其进行系统鉴定。因北方根结线虫对不同作物品种具有较强的寄主专化型，故准确鉴定病原种类，明确田间为害的优势种对防治根结线虫病具有重要意义。

通常，根结线虫采用形态学特征结合分子生物学方法进行鉴定[22-23]。雌虫会阴花纹是根结线虫重要的鉴别特征[24]，本试验中，供试根结线虫的会阴花纹肛门处有刻点，背弓缓，这与谢辉[8]描述的北方根结线虫雌虫会阴花纹特征相似，且2龄幼虫和雄虫的测量值均与Whitehead[25]所描述的北方根结线虫测量值基本相符。根结线虫近源种之间形态差异不明显，而雌虫的会阴花纹存在一定的种内变异[26]，因而无法单独根据形态学特征准确鉴定，还需结合分子生物学方法进行鉴定。本试验扩增了根结线虫胡萝卜群体的  rDNA-ITS和28S-rDNAD2D3区序列并构建系统发育树，结果显示，其序列均与北方根结线虫群体聚为一支且相似度较高。同时，北方根结线虫特异性引物Mh-R/Mh-F扩增结果与冯光泉等[14]一致，进一步证实胡萝卜根结线虫病病原为北方根结线虫。

甘肃省是北方根结线虫新分布区，这是首次在甘肃省发现北方根结线虫危害胡萝卜。临洮县气候阴湿，降雨较充足[27]，适合北方根结线虫生存。胡萝卜作为高原夏菜的重要品种，常年连作[28]，易造成根结线虫病逐步扩大、危害加重的趋势，这将成为胡萝卜生产中潜在的危险性因素。若不采取控制措施，造成北方根结线虫大量繁殖和扩散，则会对甘肃省露地蔬菜产业发展造成  威胁。

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Identification of Carrot Root-knot Nematode Pathogen in Gansu Province

Abstract Morphological and molecular biological methods were used to identified the nematode population affecting carrots in Lintao county，Gansu province.The results showed that the female nematodes exhibiting pear-shaped or lemony bodied，were milky white with a robust stylet，and had round  median bulbs.The perineal patterns of females were oval with a low dorsal arch and punctations，and typically located above the anus.The male nematodes displayed elongated bodies with obtuse tails and a pair of acicular spicula.The second-stage juveniles（J2） had elongated and helminth-shaped bodies with no obvious constriction in the labial area.Their stylets were robust with small and round basal balls，and their tails were obtuse with obvious transparent areas.A specific 462 bp fragment  was amplified from the population using Mh-R/Mh-F specific primers，consistent with that of Meloidogyne hapla.Phylogenetic trees constructed based on the rDNA ITS and 28S-rDNA D2D3 sequences of the genus meloidogyne，indicated that this population clustered with the sequences of M.hapla.This nematode population inoculated on carrots led to the symptoms consistent with those of the diseased ones in the field.After 35 days，the nematode was isolated，and its morphological characteristics matched those of M.hapla.In conclusion，both morphological characteristics and molecular biological methods identify the the pathogen as M.hapla.This is the first report of M.hapla infecting carrot vegetable crop in Gansu province.

Key words Carrot;Meloidogyne hapla; Morphological characteristics; Molecular biological; Pathogenicity; Identification